运用核磁共振技术揭示生物固体修复土壤中腐植酸的化学结构

运用核磁共振技术揭示生物固体修复土壤中腐植酸的化学结构_2015年论文集

运用核磁共振技术揭示生物固体修复土壤中腐植酸的化学结构

C.Y.Chiu1　G.Tian2　著　张水勤3　袁　亮3　译

(1　台湾中央研究院生物多样化研究中心　台北　11529

2　美国芝加哥大都市水再生利用区监控研究部环境控制研究处略兴研究室　西塞罗　IL　60804

3　中国农业科学院农业资源与农业区划研究所　北京　100081)

摘　 要：应用核磁共振技术表征长期施用2个水平生物固体的土壤中提取的腐植酸特征，以评估生物固体修复土壤中有机碳的稳定性。同时，量化土壤中富里酸、胡敏酸和Fe/Al氧化物含量。土壤样品采集于2004年，于伊利诺斯州西南部的富尔顿县选取7个地块进行取样，取样地块生物固体的累积施用量分别为0(对照)、554(低施用量)和1066(高施用量)mg/ha。结果表明，生物固体的施用增加了土壤富里酸与胡敏酸的含量，但是生物固体修复的土壤和对照土壤的FA/HA比值没有差异。此外，生物固体的施用不影响水溶性有机碳的含量，却能增加土壤有机复合体中Fe/Al含量，降低其C/Fe和C/Al比例。13C核磁共振波谱结果表明，随着生物固体的施用土壤腐植酸中烷基碳增加和芳香碳降低，且施用量越高，变化程度越大；土壤腐植酸碳结构也从由O-烷基主导变为烷基主导。生物固体的施用不能降低土壤有机碳的稳定性，相反，能够增加土壤腐殖质的稳定性。

关键词：非晶型Fe/Al氧化物　生物固体　碳化学结构　腐植酸　美国的中西部　核磁共振　土壤有机碳的稳定性

Chemical Structure of Humic Acids in Biosolids-amended Soils as Revealed by NMR Spectroscopy

C.Y.Chiu1,G.Tian2　write,Zhang Shuiqin3　,Yuan Liang3　translate

(1 Biodiversity Research Center,Academic Sinica,Taipei,11529

2 Environmental Monitoring and Research Division,Monitoring and Research Department,MetropolitanWater

Reclamation District of Greater Chicago,Lue-Hing R&D Laboratory,　Cicero,IL 60804

3 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning,CA AS,Beijing,100081)

Abstract:We used NMR spectroscopy to characterize humid acids extracted from soils that had received long-term application of 2 levels of biosolids to evaluate the soil organic matter (SOM)stability in biosolids-amended soils.The study also quantified fulvic acids (FAs),humic acids (HAs)and Fe/Al oxides.The soils were collected in 2004 from 7 fields,in Fulton County,southwestern Illinois,which received biosolids at a cumulative rate of 0(control),554(low biosolids)and 1066 (high biosolids)mg/ha.The application of biosolids increased both FA and HA contents,but biosolidsamended soil and control soil did not differ in FA/HA ratio.Biosolids application had no effect on water-soluble organic carbon content.Biosolids application increased the presence of Fe/Al in the SOM complex and lowered its C/Fe and C/Al ratios.13C NMR spectra showed increased alkyl C and decreased aromatic C content in soil HAs with the application of biosolids,and the extent of such changes was higher with high than low biosolids treatment.Under biosolids application,the soil HAs’ C structure shifts from O-alkyl-dominant to alkyl-dominant.Biosolids application does not decrease SOM stability but rather increases the stability of soil humic substances.

Key words: amorphous Fe and Al oxides;biosolids;carbon chemical structure;humic acids;Midwest United States;NMR;soil organic carbon stabilization

[收稿日期]2015-09-23

[译者简介]张水勤，女，1988年生，在读博士研究生，主要从事肥料资源利用研究，E-mail：shuiqin08@163.com。

随着生物固体土壤施用量的增加，已开展了大量生物固体施用对土壤有机碳动态影响的研究，这些研究均证实生物固体的施用能够增加土壤有机碳含量。Tian等(2009)研究指出，生物固体施用引起土壤有机碳含量增加可能源于残留的生物固体碳和作物残留碳向土壤有机碳转化的增强作用。尽管多年后土壤分解残留的生物固体碳不属于易分解的组分，但它依旧比腐殖化的土壤有机碳更容易遭受腐殖化的影响。来源于作物残体的新累积土壤有机碳没有土壤原始的有机碳稳定。因此，可以做出以下假设，生物固体的施用可能会降低土壤有机碳的稳定性。

土壤腐殖质由富里酸、胡敏酸和胡敏素构成。富里酸为结构简单、水溶性较强的低分子量组分；反之，胡敏酸为结构复杂、水溶性较差的高分子量组分。Qualls(2004)经过一年的培养实验研究，结果表明富里酸分解速度是胡敏酸的2倍，新形成的腐殖质趋向于为富里酸，它可能是腐植酸的前体(Tate，1987)。因此，生物固体施用降低土壤有机碳的假设可通过FA/HA比例反映出来。水溶性有机碳含量可提供相似的信息。

过去几十年，运用13C NMR技术确定有机材料化学结构发展迅速，然而其在土壤有机碳方面的应用仍然需要进一步研究。NMR光谱已揭示了土壤有机碳含有4个碳的功能基团：烷基碳(脂类、蜡类和脂肪族烃)，氧烷基碳(碳水化合物)，芳香碳(木质素和多酚)和羧基(多肽类和有机酸)，它们中有3种与土壤有机碳的稳定性有关。氧烷基碳含量低或烷基碳和芳香碳含量高意味着土壤有机碳稳定性的增加。一般情况下，生物固体烷基碳含量较高，长期使用实物骨头可能会使土壤有机碳中烷基碳含量增加，最终增加土壤有机碳的稳定性。然而，生物固体处理土壤的碳化学结构信息依旧缺乏，因此以上假说还没有得到证实。

Fe/Al氧化物在土壤有机碳的稳定过程中起到了至关重要的作用。由于土壤有机碳带负电，而三氧化二物带正电，一些易分解的氧烷基碳能够被吸附于三氧化二物上，以减少微生物有机体的进入。Boudot等(1989)假设不溶的Fe和Al氢氧化物降低了有机组分溶解性的损失，减少了土壤有机碳的分解性能。由于生物固体在非晶型的Fe/Al氧化物中富集，长期的生物固体施用能够增加土壤非晶型Fe/Al含量，从而导致土壤有机碳稳定性增加。与土壤有机碳结合的Fe和Al的丰度使得检测生物固体施用时Fe和Al氧化物对土壤有机碳稳定性的影响成为可能。

因此，本研究旨在通过测定腐殖质组成、碳功能基团含量和Fe/Al丰度，评价美国中西部玉米种植带土壤生物固体施用对土壤有机碳稳定性的复杂影响。

1　材料与方法

1.1　处理

研究区位于美国伊利诺斯州的富尔顿县，根据国家气象中心数据(NCDC)，该地区年平均气温为10.4℃，年降雨量1013mm。随着露天土壤再生利用，生物固体施用于未开采的农田土壤以维持土壤肥力。1972-1984年，6种生物固体修复的土壤(F19、F21、F22、F35、F36和F40)以液态生物固体的形式施用，平均累计施用量在1984年达554mg/ha(干重)，从1985到2002年，F35和F36处理分别于1991、1998和2002年额外施用3次生物固体，取样时总的累积施用量为1066mg/ha(干重)。F19、F21、F22和F40处理仅在初期有554mg/ha施入，被认为是“低量生物固体”处理。F35和F36处理既有液体生物固体又有风干生物固体的施入，总施入量达1066mg/ha，被认为是“高量生物固体”处理。F83处理作为对照处理，未有生物固体施入，但每年施用约300 N、100 P和100 K kg/ha。对照土壤的类型由Udollic Endoaqualfs和Typic Endoaquolls组成。生物固体修复的土壤类型包括Udollic Endoaqualfs (F19和F22)、Mollic Hapludalfs(F21)、Typic Hapludalfs(F35)、Aquic Argiudolls(F36)和Typic Endoaquolls/Alfic Udarents(F40)。大部分地块面积为10～20 ha，表层土壤pH为中性，质地变化较大，主要是从粉砂壤土到粉砂质黏壤土。主要种植作物为玉米、小麦和大豆轮作，不定期种植冬季覆盖作物-黑麦草或者在生物固体施用的当年休耕。

所有的生物固体均产自芝加哥，由污水处理污泥于35℃厌氧消解15天及以上而制得。厌氧消解液态的生物固体运至试验点，农田施用前在持水池中贮存数月乃至数年。为生产风干的生物固体，厌氧消解的液态或脱水的生物固体贮存于泻湖18个月后用病菌进一步还原至Class A水平。然后挖出泻湖中的材料，并平铺在台面上搅拌，直至获得大约65%的固体。液态生物固体中有机质(通常报道为挥发性固体，是生物固体熟化的指示指标)含量约为44%，风干固体约为33%；液态生物固体中Fe和Al总量平均值分别为4.4%和1.3%，风干固体中约分别为2.8%和1.2%。风干生物固体中Fe含量低于液态，主要是由于自1993年US EPS’s 40 CFR 503条例颁布后，污水中金属浓度一般较低。生物固体施入表层土壤。关于生物固体特征和施用的详细描述见Tian等(2009)。

1.2　土壤取样和加工

于2004年春天取0～15cm土壤样品。每个地块分为2部分，根据面积大小每部分取20～40个点，组成一个混合土样。为避免土壤的空间分布差异，在整个地块取样时采取随机布点的方式。每个地块的2部分土样最终混合成一个样。样品风干后，过2mm筛；取部分土样过0.25mm筛，用来测定土壤有机碳。

1.3　实验室分析

1.3.1　碳和Fe/Al

土壤有机碳含量用湿式燃烧法(Walkley和Black，1934)测定。总的游离Fe和Al氧化物含量用连二亚硫酸盐-柠檬酸-重碳酸盐(DCB)方法(Mehra和Jackson，1960)测定。非晶型的Fe和Al的氧化物含量用草酸铵(pH 3.0)浸提(McKeague和Day，1966)测定。有机结合态的Fe和Al含量用焦磷酸钠(pH 10)提取(Loveland和Digby，1984)。

1.3.2　土壤有机碳组分的提取

土壤水溶性有机碳用Millipore Milli-Q水以土水比1:30的比例连续浸提，然后以200 rpm的速度在室温下振荡6 h。提取液在10000×g的速度离心15min，上清液滤过Whatman No.42滤膜。

腐殖质用碱液浸提。非腐殖质成分用0.1 M HCl去除，然后进行FA和HA的进一步提取，即用0.1 M NaOH (土和浸提液比例为1∶10)，室温下于氮气环境中提取4 h。上清碱液用以10000×g的速度离心10min进行分离。离心过程重复3次直至溶液颜色变浅。所有的提取液混合。

上清液倒出后，用6 M HCl酸化至pH为1，且在室温下保存24 h以沉淀腐植酸。上清液为富里酸溶液，沉淀为胡敏酸，通过8000×g离心15min进行分离。胡敏酸用HCl-HF混合液进行纯化，然后用蒸馏水彻底洗涤，溶于0.1 M NaOH。

可溶性有机碳，富里酸和胡敏酸组分均通过TOC Analyzer-O.I.Analytical 1010用加热过硫酸盐氧化法分析(Clesceri等，1989)其有机碳总量。部分腐植酸组分冷冻干燥，用于进行核磁的表征。

1.3.3　固态13C交叉极化-魔角旋转(CPMAS)核磁

腐植酸组分C组成用固态13C交叉极化-魔角旋转(CPMAS)核磁进行测定。样品量为0.25g。用配有7mm直径样品管的Bruker DSX 400 MHz核磁光谱仪进行测定。数据获得条件如下所示：扫描频率100.46 MHz，扫描速度7000 Hz，接触时间6 ms和缓冲延迟时间1 s。每个样品约扫描5000次。总的信号强度和每个碳功能基团的比例按以下化学位移区域划分：0～50 ppm(烷基碳)，50～90 ppm(氧烷基碳)，90～110 ppm(二氧烷基碳)，110～165 ppm(芳香碳)和165～190 ppm(羧基碳)。甲氧基碳(50～60 ppm)在氧烷基碳区域有一个宽的肩峰。本研究中将二氧烷基碳含量加到烷氧基碳中。通过计算光谱区面积得到不同碳的官能团相对含量，并以该区域占总光谱区域的面积百分比表示。

1.4　数据分析

低量生物固体修复土壤是否与对照差异显著采用零假设单因子t检验法进行检验(Bland，2000)。由于生物固体施用土壤特性的相应比例是希望随着生物固体施用比例的增加而降低，高量生物固体处理可能不同于低量处理。因此，在高量和低量生物固体处理差异显著性检验方面，本文施用不等方差Student t检验。P<0.05被视为差异显著性的标准。

2　结果与讨论

2.1　HA/FA和水溶性有机碳

用生物固体修复的土壤富里酸和胡敏酸含量均高于对照处理(表1)，这反映了随着生物固体的施用，土壤中有腐殖质的形成。尽管施用高量生物固体的处理土壤FA/HA比例相对较高，但生物固体修复土壤与对照土壤相比，FA/HA比例并没有显著差异。低量的生物固体施用的处理是从1985年开始停止的，约为检测年份的20年前；而高量生物固体施用的处理是在2002年最后一次施用的，为取样的2年前。因此本研究的结果表明，新施用生物固体的土壤可能会具有较高含量的FA/HA比值；但是随着生物固体的降解，FA/HA比例将接近对照处理。生物固体施用对可溶性土壤有机碳的影响与其对FA/HA比值的影响相似(表1)。

正如第一段所阐述的，FA/HA比值是腐殖质稳定性的表征。因此，FA/HA结果意味着施用生物固体后土壤腐殖质的稳定性将会短暂降低；但随着生物固体施用的终止，稳定性将会得到改善，达到未修复之前的水平。土壤水溶性有机碳的结果支持以上结论。

表1　生物固体施用对土壤有机碳含量和土壤腐殖物质组成的影响
Tab.1 Effect of biosolids application on soil organic carbon (SOC)concentration and composition of humic substances in soil

注：小写字母表示5%显著水平下的差异性。

2.2　NMR

从生物固体修复和对照土壤中提取的腐植酸的固相13C CPMAS NMR光谱如图1所示。所有波谱均在化学位移23、30、56、73、105、130、148和173 ppm处出现化学位移的峰。生物固体修复和对照土壤核磁光谱图在烷基碳和芳香碳的峰处出现差异(图1)。生物固体修复的土壤烷基碳峰强于对照土壤，而芳香碳的趋势与此相反。

腐植酸碳功能团的分布计算结果如表2。腐植酸烷基碳和芳香碳含量均对生物固体施用有响应(表2)。生物固体施用明显地增加了腐植酸烷基碳的含量，且含量越高增加得越多；腐植酸的芳香碳含量随着生物固体的施用而降低；生物固体施用后氧烷基和羧基碳含量保持不变。因此，生物固体的施用使土壤腐植酸从氧烷基碳主导转化为烷基碳主导。

生物固体修复土壤烷基碳含量的增加有以下几种解释：在污水处理过程中，O2或者空气通入水流而进行曝气，使腐生细菌或其它细菌吃掉了可溶有机质，这些细菌的数量通过污泥(废活性污泥)的归还部分保持不变。因此，沉淀池内污泥中有机质含有使生物固体固有烷基碳官能团富集的细菌代谢物。本研究中生物固体的长期施用将大量增加土壤中烷基碳的量，进而导致土壤腐植酸中烷基碳含量较高。通过用葡萄糖(烷基碳)开展土壤培养实验，检测其13C CPMAS NMR光谱。Hopkins和Chudek(1997)研究发现，碳水化合物的微生物代谢作用导致烷基碳的累积。Tian等(2008)研究结果表明，生物固体的施用增强了土壤微生物活性。因此，增加的烷基碳部分也可能是由于生物固体促进了土壤微生物的过程。

氧烷基光能团主要有纤维素、半纤维素组成，它们不具有抗细菌分解的能力。烷基碳官能团被认为是最稳定的碳。Chen和Chiu(2003)研究结果表明，高山土壤细粒度部分主要累积的是烷基碳抗氧化材料。烷基碳和芳香碳结构是木炭中占主导地位的有机碳。一些烷基碳具有较高的分子移动性，这影响随着生物固体施用的化合物的应用。根据Kögel-Knabner等(1992)的研究结果，可移动的烷基比其刚性部分更容易降解。Smith等(2008)通过对生物固体处理烷基碳的检测发现，烷基碳含量随着厌氧消化的不断进行而显著降低。Piterina等(2009)也发现了类似的研究结果，即施用生物固体过程降低烷基碳含量。本研究中，生物固体的施用经受了厌氧消化，这可能会有助于易变的烷基的分解。此外，自生物固体施用后，低量生物固体处理加权平均时间为25年，而高量施用的年限为18年，这给易变的烷基足够的分解时间。因此，观测到的大部分烷基碳都应是刚性结构，尽管需要进一步研究来证实这一点。因此，生物固体的施用使腐植酸中氧烷基碳主导向烷基主导发生转变，增强了腐植酸的稳定性。Lorenz等(2007)强调，土地利用与管理方式使土壤有机碳库的增加应包括地下生物量中脂肪族化合物比例的增加，生物固体应该是实现此目的的理想候选物质。

由于生物固体芳香碳含量低于烷基碳，生物固体碳向腐植酸的转化将稀释腐植酸中芳香碳的浓度。由于芳香有机物有助于腐植酸抗分解能力，芳香碳的降低也降低了腐植酸的稳定性。总之，在生物固体施用条件下，腐植酸的稳定性保持不变。

图1　土壤中腐植酸固态13C交叉极化-魔角旋转(CPMAS)核磁图谱(A、B和C分别取自对照处理、低量生物固体处理和高量生物固体处理的地块)
Fig.1 Solid state 13C cross-polarization magic-anglespinning NMR spectra of humic acids extracted from soils collected from fields of control (A),low biosolids treatment (B)and high biosolids treatment (C)

注：(a)烷基碳；(b)氧烷基碳；(c)二氧烷基碳；(d)芳香碳；(e)羧基碳。

表2　生物固体施用对土壤腐植酸功能团分布的影响
Tab.2 Distribution of C functional groups of soil humic acids as affected by biosolids application

注：小写字母表示5%显著水平下的差异性。

2.3　Fe/Al

生物固体的施用极大程度地增加了土壤中自由铁氧化物的含量，并且施用生物固体修复的土壤中非晶型铁含量也显著高于对照土壤(表3)。土壤有机质带的是负电荷，而Fe氧化物带的是正电荷。在特定条件下，有机质和Fe氧化物能够紧密结合在一起。由于非晶型铁氧化物具有较大的比表面积，有机质-铁结合物中的Fe主要是该种形态的铁。用生物固体修复的土壤中，铁多数以非晶型形态存在，这有利于铁与土壤有机质的结合，从而导致高含量的铁与土壤有机质结合(表3)。本研究结果表明，施用生物固体降低了土壤的C/Fe比，这意味着生物固体的施用不但增加了铁与土壤有机质结合的总量，而且增加了有机质中铁的含量。土壤有机质具有较高的铁强度，可能会增加土壤有机质的稳定性。如表3所示，生物固体铝对土壤有机碳化学结合的贡献也值得注意，但是施用生物固体修复土壤后，土壤的C/Al与对照土壤的差异远低于C/Fe。

表3　生物固体施用对土壤中Fe、Al形态的影响(f、a和o分别代表游离氧化物、为非定型态和为有机结合态)
Tab.3 Species of Fe and Al in soil as affected by biosolids application (f,free oxide;a,amorphous form;o,organically bound)

注：小写字母表示5%显著水平下的差异性；C/Fe和C/Al值分别用表1中的有机碳数据和表3中的Feo和Alo进行计算。

3　结论

土壤长期使用生物固体不改变其FA/HA比值，但却能主导使土壤腐植酸的碳结构从氧烷基向具有少了芳香组分的烷基转化。它的施用能够使与土壤有机质结合的Fe/Al增加。总之，长期使用生物固体可能增强土壤有机质的稳定性。然而，本研究没有进行中间周转时期土壤颗粒碳的测定，这可能也会影响整个土壤有机碳的稳定性。

参考文献(略)

译自：Applied Soil Ecology，2011，49 ：76～80。