蚯蚓粪堆肥腐植酸缓解水稻水分胁迫的潜力

蚯蚓粪堆肥腐植酸缓解水稻水分胁迫的潜力

Andrés Calderín García1,2　Leandro Azevedo Santos1　Fernando Guridi Izquierdo2　Victor Marcos Rumjanek1　Rosane Nora Castro1

Fabiana Soares dos Santos3 Luiz Gilberto Ambrosio de Souza1　Ricardo Luis Louro Berbara1　著 李　双4　译

(1　巴西里约热内卢联邦农业大学土壤系土壤生物学实验室　塞罗佩迪卡　RJ　23890-000

2　古巴哈瓦那农业大学农艺研究所化学系　圣何塞德拉斯拉哈斯　999075

3　巴西弗鲁米嫩塞联邦大学农业工程系　尼泰罗伊　RJ　27255-125

4　中国腐植酸工业协会　北京　100120)

摘　要：评估了水分胁迫下施用腐植酸(HA)对水稻生长的影响。当水稻植株遭受水分胁迫时，施用HA可以降低植物过氧化氢酶活性，抑制根系和叶片的脂质过氧化反应，维持植物脱落酸(ABA)含量与未胁迫处理基本相同。HA对根系和叶片的水通道蛋白发挥不同的作用，其中烷基、羧基和羰基结构对植物根系发挥重要作用。试验结果表明，HA的保护性作用可能是通过独立的ABA信号传导通路，调控OsTIPs基因表达，从而激发HA与植物根系间发生物理和化学的相互作用。

关键词：过氧化物酶　脱落酸　水通道蛋白　腐植酸　水稻

Potentialities of Vermicompost Humic Acids to AlleviateWater Stress in

Rice Plants (Oryza sativa L.)

Andrés Calderín García1,2,Leandro Azevedo Santos1,Fernando Guridi Izquierdo2,Victor Marcos Rumjanek1,Rosane

Nora Castro1,Fabiana Soares dos Santos3,Luiz Gilberto Ambrosio de Souza1,Ricardo Luis Louro Berbara1　write

Li Shuang4　translate

(1 Federal Rural University of Rio de Janeiro,Department of Soil,Soil Biology Laboratory,　Seropédica,Brazil,RJ

23890-000

2 Agrarian University of Havana (UNAH),Department of Chemistry,Agronomy Institute,San José de las Lajas,

Cuba,999075

3 Fluminense Federal University,Department of Agribusiness Engineering,Volta Redonda,Brazil,RJ 27255-125

4 China Humic Acid Industry Association,Beijing,100120)

Abstract:The aim of this study was to assess the effects of applying humic acid (HA)to rice plants under water stress conditions.HA maintained peroxidase activity below the levels found in plants that were under stress without the addition of HA.Lipid peroxidation in the roots and leaves was lower in the treatments with HA compared to the plants that were under stress that were not treated with HA.Plants that were under water stress and treated with HA maintained abscisic acid levels similar to those of the control plants.HA exerted differential effects on the expression of aquaporin in both root and leaf tissues.Alkyl,carboxylic and carbonyl structures predominated in the agglomerated HA at the roots.These results demonstrate that HA exerted a protective effect possibly through signaling mechanism independent of ABA,regulation of OsTIPs genes and potentially initiated by chemical and physical interactions between HA and the plant root system.

Key words: peroxidases;abscisic acid;aquaporin;humic acids;Oryza sativa L.

[收稿日期]　2015-09-16

[译者简介]　李双，女，1983年生，博士，主要从事园林植物遗传育种研究，E-mail：chaia@126.com。

水分胁迫是最常见和最具破坏性的非生物胁迫之一，通常会造成作物大量减产。水分胁迫条件下，植物体内活性氧(ROS)含量可能会增加，当ROS达到一定浓度时，将诱导某些细胞成分发生氧化反应。

植物体内ROS的生成可能会加速对植物的损害，同时提供植物适应环境变化的信号。过氧化氢(H2O2)可以导致植物体内产生ROS，并参与植物信号传导、生长发育、防御反应、根系生长等过程。尽管一些报道表明，H2O2的基本功能是作为一种信号分子，可以反诱导氧化损伤，但其功能的发挥主要依赖于抗氧化剂、激素及H2O2在细胞中的含量。

植物对水分胁迫条件的响应很大程度上受激素控制，尤其是脱落酸(ABA)，介导植物根系向地上部分传输信号。水分胁迫下，细胞输入和输出水分受到严格控制。水分跨膜运输主要是由转运蛋白完成，如水通道蛋白。水通道蛋白也被称作主要内在蛋白(MIPs)，是调控水分跨膜运输的蛋白。液泡膜内在蛋白(TIPs)位于细胞空泡膜，其同系物具有多种功能。TIPs可以调控丙三醇、尿素、H2O2的运输，调控NH4+/NH3以甲基氨和甲酰胺形成运输。水通道蛋白活性受ABA依赖途径和ABA非依赖途径调控，特别是TIPs在水分胁迫下受ABA作用影响更大。

HA影响植物激素和根系生长发育。近来，HA在次生代谢以及盐胁迫下对植物的保护作用被发现。水稻在水分胁迫下，施用HA可以保护细胞膜的稳定性。

因此，本研究基于HA的抗氧化防御机制和定向基因OsTIPs在根系中的表达，评估蚯蚓粪堆肥HA在水分胁迫(聚乙二醇—PEG)下对水稻的保护性作用。

1　材料与方法

1.1　蚯蚓粪堆肥HA的特性

根据腐殖质学会推荐方法，从存放3个月的畜禽粪便堆肥中，提取和纯化HA。元素组成使用LECO TruSpec®　CHN测量仪进行测定。使用VERTEX 70 FTIR系列分析仪在4000～400cm-1范围内，测定KBr(5mg)/HA(200mg)的傅里叶变换红外光谱(DRIFT)。

CP-MAS 13C-NMR光谱使用UltraShield NMR测量仪在400 MHz交叉极化脉冲序列、30℃、100.61 MHz测试频率下测得。疏水性和亲水性指数(HB/HL)之间的比率计算：HB/HL=[(0～46 ppm)+(110～142 ppm)]/[(46～110 ppm)+(142～230 ppm)]。芳香度和脂肪族的计算方法参照Song等(2008)的方法。

利用扫描电镜(SEM)，通过平面扫描采集HA的形态图像。样品处理方法：在样品表面涂上一层薄薄的金层(5 nm)，沉积120 s，随后采用扫描电镜EVO MA10，在高真空10 kV条件下，分别用25倍、200倍、3000倍的放大倍数进行观察，结果见图1。

图1　HA扫描电镜图
Fig.1 Scanning electron microscopy (SEM)images of HA

注：A为25×，即放大25倍；B为200×，即放大200倍；C为300000×，即放大300000倍。

1.2　试验材料和植株生长条件

水稻植株(栽培品种日本粳稻)在培养室内进行培养，光周期为12 h，光照度为250 umol/s m2，相对湿度79%，昼夜温度28℃/24℃。种子采用2%次氯酸钠溶液进行消毒处理，并用无菌水冲反复洗。6天后种子发芽，转入0.4 L含有25% Hoagland营养液的钵中。3天后，营养液浓度增加到50%。植株水分胁迫处理采用28%的甘油二酯(DAG)和含有15%聚乙二醇6000(PEG-6000)的营养液，PEG-6000渗透压约为-0.82 mPa。24 h后，分别加入20、40、80mg C/L HA至营养液中。试验共分5个处理：T1(-P-HA)—空白对照，T2(+P-HA)—添加PEG-6000而不添加HA；T3(+P+HA20)—添加PEG-6000和20mg C/L HA，T4(+P+HA40)—添加PEG-6000和40mg C/L HA，T5(+P+HA80)—添加PEG-6000和80mg C/L HA。

1.3　过氧化物酶(POX)活性测定

胁迫处理植株在添加HA后，每4 h进行一次POX活性测定，4～24 h间共测定6次。提取方法在Kar和Mishra(1976)、Júnior(2007)方法基础上进行了一定修改。从根系和叶片中提取100mL酶提取物，添加到2.9　mL的反应混合物中，混合物包括磷酸盐缓冲液(2.5　mM，pH值6.8)、邻苯三酚(20mm)、H2O2(20mm)。反应1 min后，测量470nm、25℃条件下吸光度增加值，以此作为红棓酚产量。POX活性测定选择最适的反应时间(0.2～0.4 min)，采用摩尔消光系数2.47mm-1cm-1进行测定。

1.4　H2O2含量测定

测定植株叶片和根系的H2O2含量(测定时间为胁迫处理8 h和24 h)。植物组织在液氮中用2.0　mL磷酸缓冲液(50mm，pH 6.5)和1mm羟胺研磨均匀。提取液在4℃、10000转条件下离心15min，收集上清液。取20 μL上清液加到2.0　mL反应体系：100 μM　FeNH4(SO4)，25mm硫酸，250 μM二甲苯酚橙，100mm山梨醇。样品在黑暗中培养，并在560nm处读取吸光值。依据标准曲线计算H2O2含量。

1.5　脂质过氧化反应评估

丙二醛(MDA)含量测定根据Dhindsa和Matowe(1981)方法，分别在8 h(POX活性开始增加)和24 h(反应结束)。加入500mg植物组织到6 mL三氯乙酸(10%)中混匀，10000转离心15min。之后，取上清液，加入2 mL硫代巴比妥酸，混匀，加热(100℃，20min)，迅速冷却，10000转离心10min。分别读取450、532、600nm处吸光值，根据公式计算MDA含量。MDA=6.45×(A532-A600)-0.56×A450。

1.6　ABA含量测定

ABA含量测定根据Kelen(2004)方法，使用日本岛津公司生产的液相色谱仪进行测定。测定时间为反应后8 h，即POX活性开始增加时。液相色谱仪由电脑控制。色谱柱用十八烷基-C18分析柱(250×4.6mm，5 μm粒径，日本岛津公司生产)。

1.7　水稻液泡膜蛋白基因表达(OsTIPs)

水稻液泡膜蛋白基因表达测定时间为反应后8 h(POX活性开始增加时)。根据Gao等(2001)方法提取总RNA，用DNaseⅠ酶进行消化处理。取1 μg RNA，使用高保真RNA合成cDNA试剂盒，按照使用说明合成cDNA。使用SYBR®　Green PCR试剂盒进行实时定量PCR，以脉动蛋白基因(NM_001057621.1)作为阳性对照。引物分别为OsTIP1;1(LOC_Os03g05290)和OsTIP1;2(LOC_ Os01g74450)，OsTIP2;1(LOC_Os02g44080)和OsTIP4;1(LOC_Os05g14240)。实时定量PCR参数为：95℃预变性10min，95℃变性15 s，60℃延伸1 min。共40个循环，60～95℃每增加一个循环增加0.3℃。以不添加PEG和HA处理(-P-HA)作为空白对照。

2　结果与讨论

2.1　蚯蚓粪堆肥HA的光谱特性

HA的元素组成如下：碳52.22%，氢7.58%，氧36.94%，氮1.85%，硫1.41%，其元素组成与国际腐殖质学会的HA标准相似。HA红外光谱在频率为3412.7　cm-1处出现宽而强谱带(羟基和醇基基团的νO-H键，νN-H键)。频率为2930cm-1和2851.3　cm-1处分别出现ν脂肪CH2和CH3基团的C-H非对称伸缩振动谱带。频率为1714.7cm-1处的振动谱带为羧羟基团νC-O键。振动剧烈且波动范围较宽的谱带出现在频率为1650.4cm-1处，为芳香环的C=C键、醌类和酰胺的νC=O键(酰胺Ⅰ)。频率为1542.9　cm-1处的谱带为酰胺Ⅱ的δN-H和νC=N键以及芳香结构的νC=C键。频率为1460.0cm-1和1422.5　cm-1处的谱带为CH3基团的γC-H键、酚类的δO-H键和νC-O键。频率为1223.6　cm-1处的谱带为醚类基团的νC-O键。频率为1125.4～1034.7cm-1处的谱带为多糖和类似结构的γC-H键。

CP-MAS 13C-NMR光谱测定结果显示，HA碳结构中含有22.44%的烷基碳(0～46 ppm)，16.32%的甲氧基和氮烷基碳(46～59 ppm)，11.22%的氧烷基碳(59～91 ppm)，9.18%的二氧烷基碳和芳香结构(91～110 ppm)，21.42%的芳香碳(110～142 ppm)，8.16%的羧基、酰胺和酯类碳(156～186 ppm)，7.14%的氧芳香碳(142～156 ppm)，4.08%的羰基碳(186～230 ppm)。HA芳香族化合物占28.57%，脂肪族占71.42%，HB/HL的比率为0.78。蚯蚓粪堆肥(VC源)HA通常含有大量官能团，这已经在其他研究中得到证实。CP-MAS 13C-NMR 光谱也表明，HA结构中含有大量的疏水结构(芳香碳和烷基碳)。有报道表明，HA中的疏水结构与拟南芥、玉米、番茄根系生长的刺激作用呈正相关关系。Canellas等(2012)研究表明，HA中疏水结构的损失会损害其生物活性。Aguiar等(2012)发现，更成熟的VC源HA(90天和120天)中HB/HL比率较高，可以更大程度地刺激根系生长。

25倍扫描电镜结果显示，HA的形态结构包括团聚体和层流2种状态。200倍扫描电镜结果显示，HA含有粗糙表面，以不规则、细长的团聚体形式存在，表面扩展的小突起表明结构塌陷区。Senesi等(1996)观察泥炭HA显微照片的结果显示了一样的形态结构。Li等(2011)从VC源中提取的HA也观察到了这些结构。

2.2　POX活性、H2O2含量和脂质过氧化反应(MDA)

POX活性在水稻叶片和根系中相似(图2A、图2B)。可以看出胁迫诱导2 h后，样品中添加HA处理的植株POX活性均高于对照，说明在植物体内发生了氧化应激反应。但是，在胁迫处理8～24 h时，添加HA处理的植株POX活性低于+P-HA处理。所有处理在胁迫8 h后POX活性均达到最高，到24 h时活性保持不变或下降。添加HA处理的水稻植株受到水分胁迫后降低了叶片和根系的POX活性。

与对照相比，H2O2含量在胁迫处理8 h和24 h时明显增加，证实了PEG-6000胁迫诱导植株发生了氧化应激反应(图2C、图2D)。+P-HA处理植株叶片和根系H2O2含量在处理8 h和24 h时增加，这可能是POX活性高导致的。胁迫处理8 h和24 h时，3个+P+HA处理叶片中H2O2含量低于+P+HA处理。3个+P-HA处理根系H2O2含量在8 h时均低于+P-HA处理；而在胁迫处理24 h时，仅+P+HA20处理H2O2含量下降。

胁迫处理8 h和24 h条件下，植物叶片和根系中的脂质过氧化程度比其他处理高，而最高水平的过氧化反应发生在8 h(图2E、图2F)。+P+HA处理与+P-HA处理相比，脂质过氧化程度低。叶片脂质过氧化作用与对照没有显著差异。

试验结果表明，虽然+P+HA处理叶片和根系POX活性比+P-HA处理低，但是+P+HA处理的H2O2含量在8 h和24 h时均比+P-HA处理低(除了+P+HA40和+P+HA80处理)，说明胁迫条件下添加HA处理可以降低植株脂质过氧化程度。上述数据证明添加HA 可以减轻PEG诱导胁迫对植物生长的影响。

Cordeiro等(2011)研究结果表明，HA可以影响玉米植株抗氧化机制，包括增加过氧化氢酶(CAT)活性和增加ROS产量。García等(2012)通过对各种抗氧化酶活性分析，包括POX、CAT、抗坏血酸过氧化物酶(APOX)和超氧化物歧化酶(SOD)等，证明了不同浓度的HA可以调控ROS含量。与胁迫植株相比，VC源HA的保护功能可以促进水稻植株生长。

图2　POX活性、H2O2含量及脂质过氧化MDA含量
Fig.2 POX activity,H2O2　content,and lipid peroxidation measured as MDA content

注：A、B为POX活性，C、D为H2O2含量，E、F为MDA含量；A、C、E为叶片；B、D、F为根系；大写字母表示在8 h和24 h的值；小写字母表示不同处理平均值之间在Tukey’s检验下的差异，P＜0.05，下同；误差线代表3个重复间的标准误差，下同。

2.3　植物组织ABA含量

不同处理条件下，水稻叶片和根系中ABA含量见图3。水分胁迫8 h时，+P-HA处理的水稻叶片和根系中ABA含量增加。但是，添加HA处理植株的ABA含量与未经胁迫处理相似。结果表明，水稻植株在水分胁迫条件下，营养液中添加HA可以减少植株体内ABA含量，或防止内源性ABA含量增加。因此可以推断，添加HA可以通过ABA非依赖性作用途径缓解胁迫伤害，因为添加HA不会导致植株ABA含量增加。然而有研究表明，在黄瓜根部施用低浓度HA(5mg C/L)和高浓度HA(100mg C/L)后4 h和72 h，ABA的合成量增加。虽然如此，很少有研究揭示水分胁迫下施用HA的效果及其对ABA合成的影响。在本研究中，添加HA减轻水稻水分胁迫影响很可能是因为诱发ABA非依赖性作用途径。

图3　根系和叶片ABA含量
Fig.3 ABA content in roots and leaves

注：A为根系，B为叶片。

2.4　水稻液泡膜水通蛋白基因表达

各处理水稻叶片和根系中OsTIPs基因表达情况见图4A、图4B。+P+HA20处理、+P+HA40处理与-P-HA处理结果相似。+P+HA80处理抑制水稻叶片和根系OsTIPs基因表达，可能与HA浓度较高有关。这与García等(2012)研究结果一致。

图4　水稻植株中OsTIPs基因表达
Fig.4 Gene expression of OsTIPs in rice plants.

注：A为水稻根系OsTIPs 基因表达；B为水稻叶片OsTIPs基因表达。

有研究证明TIPs基因在植物新陈代谢中具有重要作用。在拟南芥中，AtTIP1;1、AtTIP1;2、AtTIP2;1和AtTIP4;1可以促进尿素运输到胞质。同样，拟南芥中沉默基因AtTIP1;1诱导细胞和植株死亡。TIPs活性受环境因子调控，包括水分胁迫条件下通过转录和转录后的路径调控。ABA 调控水通蛋白功能主要通过ABA依赖性信号传导途径和ABA非依赖性信号转导途径。

水稻植株叶片和根系中OsTIP1s基因表达受ABA和PEG诱导，OsTIP2;2和OsTIP4;2基因对ABA和PEG的响应模式相似。本研究中，只有+P-HA处理内源ABA含量增加，OsTIP1;2基因表达少量增加，表明ABA可能调控AtTIP1;2基因表达(图2A、图2B)。添加20、40mg C/L HA处理，ABA含量和OsTIP1;2基因表达量与对照处理相似。

2.5　HA与植物根系相互作用的CP-MAS 13C-NMR特征

HA与植物根系之间相互作用非常重要。根据研究报道，HA在植株根系表面形成聚集层，因此可以减少水分胁迫条件下根系的导水率。本研究结果表明，HA与植物根系之间具有强烈的相互作用，诱导HA向根系团聚(图5B-a)，这在根系表皮和最年轻的根毛中可以观察到(图5B-b)。

植物根系团聚的HA与试验开始时添加的HA表现出不同的光谱特征(图5A)。根部聚集的HA复杂程度低于添加的HA。光谱表现出更少的峰，尤其在相应的芳香碳和含氧芳烃(110～156 ppm)。此外，最近的研究表明，HA在水稻根系团聚具有相似性的光谱特性，不受水分胁迫影响。

团聚在植物根系的HA碳原子类型不同(表1)。根据检测结果，在添加HA处理中，直接作用于根系的以烷基(0～46 ppm)、羧基(156～186 ppm)和羰基(186～230 ppm)化合物为主。而团聚的HA中二氧烷基(91～110 ppm)、烷基(110～142 ppm)、氧烷基(142～156 ppm)减少。

近来的研究结果表明，在VC源HA中，甲氧基、芳香烃、氧烷基和羧基混合物对玉米根系生长具有显著影响，说明溶液中低浓度的HA促进根系生长与HA大分子中的疏水性极性分子有关。本研究的结果有助于理解这种相互作用关系。HA水解后释放有机酸，通过植物根系和极性生物片段，促使疏水分子团聚在根系表面。由于pH值的降低，通过静电相互作用或者范德华力相互作用，导致释放疏水片段，并使它们进入植物。这种HA与植株根系相互作用的化学和物理现象，有助于根的功能发生变化，这通过植物的抗应激反应机制和进入的生物活性片段已经证明。

图5　HA在植株根系沉淀CP-MAS13C-NMR光谱(A)及HA粘附在根系表面图像(B)
Fig.5 CP-MAS13C-NMR spectra of the added HA and the HA that precipitated on the roots of the plants(A),and photographs of plant roots with agglomerated HA(B)

注：B中a为HA粘附在根系面；b为HA聚集在根表皮和最年轻的根毛上；c为添加HA的光学显微图像。

表1　不同量HA处理在植株根系团聚的 CP-MAS 13C NMR光谱结构相对丰度
Tab.1 Relative abundance of the structures obtained from the CP-MAS13C NMR spectra of the agglomerated HA at the roots of the plants and the added HA

3　结论

从VC源中分离的HA主要化学机构是疏水结构。虽然在水胁迫下各种浓度HA处理可以使水稻植株根系中POX活性维持在低于未添加HA处理的水平，但是添加3种浓度HA处理叶片中H2O2含量低于胁迫条件未添加HA处理。在根系中，添加40、80mg C/L HA处理H2O2含量并未减少。添加3种浓度HA处理植株叶片和根系脂质过氧化程度较低。水分胁迫下，添加HA处理的植株重建了ABA水平，使植株不受水分胁迫影响，表明HA通过ABA非依赖途径诱导应力。营养液中添加80mg C/L HA处理水稻植株叶片和根系OsTIPs基因表达量减少。CP-MAS 13C-NMR光谱显示，根系团聚的HA以烷基(0～46 ppm)、羧基(156～186 ppm)和羰基(186～230 ppm)化合物为主，二氧烷基(91～110 ppm)、烷基(110～142 ppm)、氧烷基(142～156 ppm)化合物则较少。植株水分胁迫条件下，很可能通过ABA非依赖途径作用机制调控OsTIPs基因表达，这些效应很可能是由于HA与水稻根系间的物理和化学作用引起的。

致谢和参考文献(略)

译自：Journal of Geochemical Exploration，2014，136：48～54