腐植酸选择性降解及分子量测定研究

腐植酸选择性降解及分子量测定研究_2011年论文集

腐植酸选择性降解及分子量测定研究

樊兴明 张义超 张  钊 周霞萍

（华东理工大学资源与环境工程学院 上海 200237）

摘  要：天然腐植酸资源丰富，腐植酸的选择性氧化降解及合成研究涉及的机理复杂、应用领域宽。腐植酸用于医药，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用，同时对提高免疫能力、解毒及对内分泌都产生影响。通过超声活化、生物降解等方法对原料煤进行预处理，有效的提高了原料煤中腐植酸和黄腐酸的含量，其中生物降解褐煤、风化煤9～30 d，棕腐酸、黑腐酸含量增加302.56%，黄腐酸含量增加393.99%；并通过对冰点下降常数的修正，建立了适合黄腐酸的分子量测定方法，修正后的冰点下降常数K=3.94 kg·K·mol-1，结合毛细管电泳、液-质色谱联用证明了方法的可靠性。

关键词：腐植酸 黄腐酸 选择性降解 冰点下降法 分子量测定

Research on the Selective Degradation and Molecular Weight of Humic Acid

Fan Xingming, Zhang Shiwan, Zhan Zao, Zhou Huazhong

(College of Resource and Environmental Engineering, East China University of Science and

Technology, Shanghai, 200237)

Abstract: Humic acid is rich in natural resources. It is complex in mechanism and wide in application to do research on selectively oxidation and synthesis of humic acid. For application in the field of medicine, humic acid has effects on anti-inflammatory, antibacterial, anti-virus, anti-tumor as well as immunity, detoxification and endocrine. Content of humic acid and fulvic acid in raw coal was effectively raised by such pre-processing as ultrasonic activation, chemical oxidation activation and biological degradation activation in my study. Content of lignite fulvic acid was increased by 393.% after treatment of bacterium for 9~30 days with degradation rate of ulmic acid and humic acid up to 302%.,and a new way of molecular weight determination for fulvic acid was established by modification of cryoscopic constant which was proved by the detection of capillary electrophoresis and LC-MS. The modified cryoscopic constant turned out to be 3.94 kg•K•mol-1.

Key words: humic acid; fulvic acid; selective degradation; modification of cryoscopic constant; molecular weight determination

腐植酸广泛存在于低阶煤如风化煤、褐煤和泥炭中[1～3]。大量研究表明[4，5]，腐植酸具有消炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用，同时对提高免疫能力、解毒及对内分泌都产生影响，但腐植酸结构复杂，作用机理阐述困难，大大限制了它的应用。

关于分子量测定，GPC是一种常用方法。但GPC测定的生物质，分子量都较大，不适于测定低分子量物质[6～8]。对于分子量低于1000的腐植酸测定，目前只有张德和[9，10]等采用沸点升高法和蒸汽渗透压法，测定了巩县风化煤黄腐酸和湛江泥炭分级后的黄腐酸分子量，其他文献报道则很少。

本研究采用超声波活化、微生物菌(生物酶)选择性降解的方法，得到结构相对单一的黄腐酸降解物，采用改进的冰点下降法测定腐植酸(和黄腐酸)分子量，并结合毛细管电泳、液-质色谱联用分析证明方法的可靠性，尚未见有文献记载。

1  实验部分

1.1 原料及试剂

风化煤腐植酸，新疆哈密腐植酸有限公司提供；泥炭腐植酸、褐煤腐植酸，云南石屏县科技局提供。

1.2 实验仪器与分析

1.2.1 实验仪器

HWS26型电热恒温水浴锅，RT-02A型粉碎机，77-9型贝克曼温度计，Bechman COULTER MDQ毛细管电泳仪，傅立叶变换红外光谱仪，气相色谱-质谱联用仪，质谱检测器，液相色谱-质谱联用仪，Cw2000超声微波萃取仪，黄腐酸分子量测定装置见图1。

图1 冰点下降法测定黄腐酸分子量的装置示意图
Fig.1 Skech map of equipment for molecular of fulvic acid by cryoscopic method

1.2.2 实验分析

水分，灰分，总腐植酸含量，黄腐酸含量分析均采用国标方法测定，黄腐酸分子量测定采用改进的冰点下降法测定。

1.3 实验方法

1.3.1 超声波活化选择性降解腐植酸和黄腐酸

取一定量的腐植酸，分别加入一定量的水溶液，保证液固比为值2～5，将pH值为1～13的溶液分置于容器中，在不同的功率下超声活化10～30 min，然后测定煤中腐植酸和黄腐酸的含量。

1.3.2 生物法选择性降解腐植酸

取一定量的腐植酸，按腐植酸∶微生物菌∶水为20∶0.2∶100的质量比例混合，生物发酵，定时取样，研究腐植酸和黄腐酸含量与选择性降解的关系。

1.3.4 腐植酸和黄腐酸分子量测定与选择性降解的关系

调节贝克曼温度计测量范围到0℃左右，调节冰浴温度-5～-4℃，在测量管内移入一定量的去离子水，插入贝克曼温度计，不断缓慢的搅拌试液，测定其凝固点Tf*，用同样的方法测定待测黄腐酸溶液的凝固点Tf，平行实验组相差应小于0.004 ℃。

分子量的计算公式如下：

式中，MB为溶质B的分子量(kg/mol)；C为稀溶液的浓度(g/L)；ρ为纯溶剂在凝固点时的密度(kg/L)；Kf为所测定的修正的冰点下降常数，用于黄腐酸具有类似性质的结构类似物水杨酸、草酸和邻苯二甲酸氢钾溶液测定，并用黄腐酸分子结构类似物作模型化合物。

2  结果与讨论

2.1.1 原料腐植酸的基本性质

实验采用国标方法对原料腐植酸的水分、灰分、腐植酸、黄腐酸含量做了基本的测定，结果见表1。

表1 原料腐植酸基础数据一览表
Tab.1 Basic data for humic acid

注：括号里的数值为干基数据。

2.1.2 超声活化法与黄腐酸含量的影响

图2是不同功率条件下，超声波活化降解泥炭腐植酸后黄腐酸含量对比图。可以看出，泥炭中黄腐酸的含量得到了很大的提升，而且功率越大，提升的含量越明显，在100%全功率下黄腐酸的含量增加了144%。这是由于超声波使水溶液产生空化效应，空化效应可产生局部高温、高压，促使水分子形成自由基OH·和H·。这些含有未配位电子的自由基，直接氧化水溶液中的腐植酸，使腐植酸的O/C和H/C提高，酚羟基和醌基增加，缩合芳香结构变小，生成黄腐酸。通常来说，超声波的频率和功率越高，所产生的空化效应越强，腐植酸降解率越大，降解产物黄腐酸越多。但超声波频率也不能太高，否则自由基的氧化能力过强，直接把腐植酸和黄腐酸氧化成二氧化碳，反而导致黄腐酸含量降低。

图2 超声波功率和泥炭黄腐酸含量变化曲线
Fig.2 Ultrosonic power effects on fulvic acid content of peat

2.1.3 选择性生物降解与黄腐酸含量的变化规律

实验采用2种菌(白颜色的称之为白菌，黄颜色的称之为黄菌)，按风化煤腐植酸∶微生物菌∶水为20∶0.2∶100的质量比例投样，并加入一定量的培养基进行生物发酵，每隔4天取样，测定腐植酸和黄腐酸含量。

选择性生物降解与腐植酸和黄腐酸变化规律如图3、图4所示。

图3 不同菌种对风化煤腐植酸含量的影响
Fig.3 Effects on HA content of weathering coal by different bacteriums

图4 不同菌种对风化煤黄腐酸含量的影响
Fig.4 Effects on HA content of weathering coal by different bacteriums

从图3可以看出，在实验前12 d，风化煤腐植酸的含量持续上升，在12 d左右达到最大，这是因为微生物在以芳香性的腐殖化物质(HS)作为碳源的同时，将其氧化降解成腐植酸，形成羧基、酚羟基等，增加了表观腐植酸的含量。而之后又开始下降，使图3曲线近似呈抛物线状态。这是因为原有的腐植酸分子也开始继续降解，形成非腐植酸的醋酸等，甚至最终氧化降解为CO2、H2O。由图3可知，在这个时间段，白菌选择性降解效果比黄菌好。

由图4可见，采用白菌和黄菌选择性生物降解使风化煤中黄腐酸含量分别提高了90.84%和81.09%，其降解规律如图3。在氧化降解形成羧基等官能团的同时，过度氧化也可以使芳烃开环，使脂肪烃氧化，最终降解为CO2、H2O。

采用上述方法分别对风化煤泥炭腐植酸和褐煤腐植酸进行相关实验，降解3～30 d后测定黄腐酸的含量，实验结果见表2。

表2 生物降解泥炭腐植酸及褐煤腐植酸后黄腐酸含量变化
Tab.2 Fulvic acid content of peat HA and lignite HA after treatment of microbiology

从表2可知，在3 d的短期降解过程中，黄腐酸含量都增加了一倍左右，这证明泥炭腐植酸和褐煤腐植酸具有良好的生物活性，生物降解效果优于风化煤腐植酸；从表中还可看出，白菌的生物降解性能优于黄菌，褐煤腐植酸相对于泥炭腐植酸而言，是更适合生物降解的煤炭腐植酸。所以实验继续延长白菌对褐煤腐植酸的降解时间，定时取样，测定其黄腐酸含量的变化，结果见图5。

图5中，白菌选择性降解褐煤腐植酸后黄腐酸的含量持续升高，基本呈线性增加，到第9天后黄腐酸含量增加到36.93%，实验测得第9天褐煤腐植酸中棕、黑腐酸降解率达到48.99%。

2.1.4 腐植酸降解物(黄腐酸)分子量测定研究

(1) 采用冰点下降法测定黄腐酸分子量的建模研究。

(A) 冰点下降常数K值的测定。

冰点下降法选用水做溶剂，溶于水的大部分溶质会在水中电离，部分溶质也会在水中通过氢键缔合，使分子量的测定偏离正确的数值，黄腐酸是一种含有羟基羧基结构的物质，容易与水通过氢键缔合，直接采用冰点下降法测定黄腐酸的分子量会导致较大的误差。因此，应用冰点下降法测定黄腐酸分子量必须对水溶液中溶质的部分电离和缔合进行修正，确定冰点下降常数K。

根据张德和等测定黄腐酸分子结构的结果，选用与黄腐酸有同样官能团的水杨酸、草酸和邻苯二甲酸氢钾为标准模型物，配成一定浓度的水溶液，用已知分子量反推K值，得到结果见表3。

图5 白菌活化褐煤黄腐酸含量随时间变化曲线
Fig.5 Effects on FA content of lignite by treatment of white
bacterium for different long time

表3 冰点下降常数K值测定
Tab.3 Determination of cryoscopic constant

从表3可以看出，一定浓度下标定的模型物冰点下降常数K值很接近，可以认为是一个常数。经过关联K值与溶质浓度的关系，使一定浓度范围内的K值保持恒定，从而测定出黄腐酸的分子量。通过关联出的表3数据可以推论，氢键缔合在测定体系中起主导作用，溶质在水中解离后使水中的质子数增加，K值减小，但电离作用对K值的影响很小，因此，电离能力最强的邻苯二甲酸氢钾标定出来的K值最低，只比电离能力最差的水杨酸低了2.01%。

K值取上述3种物质标定出来的平均值，K=3.94 kg·K·mol-1。

(B) 修正后K值的验证。

为了检验修正后的K值是否可以用于黄腐酸分子量的测定，继续选用黄腐酸分子结构类似物及其混合组分作模型物，配成一定浓度的水溶液，测定其分子量，并与理论值做比较，结果见表4。

表4 用冰点下降法测定模型化合物的分子量
Tab.4 Molecular weight results of structural analogues by cryoscopic method

从表4可以看出，含有芳香环及羧酸和羟基的化合物，运用修正的水冰点下降常数，可以较准确的测定出其分子量。而当水溶液中有盐组分时，应按盐全部电离的状态，进行分子量的修正，否则数据会偏低。

(2) 冰点下降法测定黄腐酸分子量的研究。

实验采用白菌，按照上述 2.1.2、2.1.3的实验条件，根据2.1.4冰点下降法的数学模型，测定降解后黄腐酸分子量，结果见图6。

图6 选择性超声降解/生物降解对黄腐植酸分子量的影响
Fig.6 Molecular weight comparation of fulvic acid with or without ultrasonic

从图6可以看出，与降解前的原料相比，超声波、微生物降解以及超声+生物降解法后，分子量都有一定程度的降低，单纯生物降解腐植酸后测定黄腐酸分子量为578.26，而采用采用超声波+微生物降解氧化腐植酸后黄腐酸分子量为512.99。这是由于低功率的超声波，产生的空化作用较小，对细胞产生的破坏很小，并能有效促进可逆渗透，从而加强细胞内外物质运输，加快腐植酸降解速率，促进黄腐酸的生成。

(3) 冰点下降法测定黄腐酸分子量与其他仪器分析法的比较研究。

实验对单纯生物氧化降解腐植酸后黄腐酸采用改进冰点下降法测定其分子量，同时对黄腐酸进行毛细管电泳，条件如下：紫外检测波长：200 nm；缓冲液：50 mmol/L硼酸盐pH值为9.51；进样方式：自动进样30 kv；进样时间：0.5 s。计算黄腐酸分子量，结果见表5。

表5 黄腐酸分子量测定一览表
Tab.5 The table of molecular weight of fulvic acid

由表5可知，采用冰点下降法与毛细管电泳对比，误差仅为1.92%，互证显示：冰点下降法测定黄腐酸分子量可以满足测定需求。

实验采用由超声波+生物降解法氧化降解腐植酸后的黄腐酸试样，通过改进的冰点下降法测定其分子量为512.99；同时以上述试样，采用液-质色谱联用测定分子量，以检验冰点下降法测定黄腐酸分子量的可靠性，结果见图7。

图7 褐煤腐植酸生化降解后黄腐酸的LC-MS分析图谱
Fig.7 LC-MS results for lignite fulvic acid by treatment of bacterium humic acid

由图7可以看出，生化法降解褐煤所得黄腐酸分子量主要在500左右，用冰点下降法测得该黄腐酸的分子量与LC-MS结果很接近，误差为2.60%，证明了冰点下降法测定黄腐酸分子量的准确性；另外，LC-MS的结果也证明确实得到了分子量在500左右的物质。

3  结论

(1) 对原料腐植酸选择性氧化降解，可以有效提高腐植酸和黄腐酸的含量，其中生物降解褐煤腐植酸9～30 d棕、黑腐酸含量增加302%，黄腐酸含量增加393%；超声协同生物氧化可以更有效的降解FA，分子量为512.99。

(2) 在水溶液中，采用冰点下降法测定黄腐酸分子量时，必须对黄腐酸水溶液的解离常数和氢键缔合力进行修正。一定浓度范围内的黄腐酸解离和缔合能力相近，本研究测得冰点下降常数K=3.94 kg·K·mol-1。

(3) 采用自行搭建的冰点下降测定仪，可以快速准确地测定黄腐酸的分子量，与毛细管电泳对比误差为1.92%，与液-质色谱对比误差为2.6%。

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