低阶煤降解微生物菌群的分离及其降解效果研究

低阶煤降解微生物菌群的分离及其降解效果研究_2011年论文集

低阶煤降解微生物菌群的分离及其降解效果研究

高同国 姜  峰 杨金水 袁红莉

（农业生物技术国家重点实验室 农业部农业微生物资源及利用重点开放实验室

中国农业大学生物学院 北京 100193）

摘  要：本研究从不同地域低阶煤中分离筛选得到低阶煤降解菌群，选取其中降解能力最强的菌群，对其降解内蒙霍林河褐煤产生的黄腐酸特性及产品效果进行初步研究，并与真菌(Penicillium s p.P6)降解内蒙霍林河褐煤得到的黄腐酸进行比较，研究褐煤经不同微生物降解后黄腐酸的特性及生物活性的差别。结果分离到优势降解菌群3个，紫外-可见光光谱，红外光谱表明SL-2降解褐煤得到的黄腐酸与P6降解褐煤得到的黄腐酸在结构上有所差别；生菜发芽的效果表明，两种黄腐酸均表现出植物生长调节剂类似物的性质，但由于不同微生物降解产生的黄腐酸在官能团结构和数量上有所差别，黄腐酸对根和茎生长的作用和浓度不尽相同。

关键词：低阶煤 褐煤 菌群 黄腐酸 微生物

Study on the Isolation and Degradation of Bacterial Consortium From Low-Rank Coal

Gao Tongguo, Jiang Feng, Yang Jinshui, Yuan Hongli

( State Key Lab for Agrobiotechnology

Key Llaboratory of Agro-Microbial Resource and Application, Ministry of Agriculture

College of Biological Science, China Agricultural University, Beijing, 100094)

Abstract: Bacterial consortium was isolated from low rank coal collected from different places. The character and biological activity of fulvic acid, produced by the effective mixed-culture, were studied, and compared with the fulvic acid produced from lignite by Penicillium sp.P6 in this work. The results showed that 3 consortia have the ability to degrade the weathered coal, and the SL-2 was the most effective one. Ultraviolet-visible absorption spectroscopy and FT-IR spectra results indicated the character of fulvic acid produced by degrading lignite by SL-2 and P6 were different .The effect of the two fulvic acids on the lettuce was also studied. The results showed fulvic acid have the of hormone-like activity on plant growth, but different fulvic acid have different way to stimulate the plant on shoot and root.

Key words: low- rank coal; lignite; bacterial consortium; fulvic acid; microorganism

黄腐酸(fulvic acid，简称为FA)又被称作富里酸，是腐植酸中分子量最小、生物活性最强、水酸碱均可溶的组分，黄腐酸在工业、农业、化工、医药上都有广泛的应用。在农业上黄腐酸具有刺激植物根系生长，提高根系活性，提高叶绿素含量，缩小气孔开放度，提高三羧酸循环关键酶活性[1]，改善产品品质，提高作物产量等作用，并且越来越多的实验结果表明黄腐酸具有植物生长调节剂的性质[2，3]。黄腐酸的来源不同，其化学组成略有不同，因此不同来源的黄腐酸在相同植物上的作用效果，以及同一种黄腐酸在不同植物上的作用浓度不尽相同。

自然环境中任何物质的降解都是多种微生物协同完成的，单一降解菌具有产生的降解酶种类单一，降解不完全等缺点。20世纪80年代人们开始研究不同微生物间的相互协同作用，利用不同菌的特点及相互作用达到降解目的，并形成了混合培养技术。虽然混合培养具有单一菌种不具有的优点，但是目前的混合培养技术主要由纯培养的菌株组合起来的，而以纯培养的方式获得的微生物只占样品中微生物种类的1%[4]，绝大多数的微生物是不可培养的，导致自然界中很多的高效微生物无法纯培养得到。菌群发酵技术是近年来发展较快的技术，其菌群一般是从样品中直接培养，富集得到，与单一降解菌及混合发酵技术相比，菌群发酵具有降解彻底，易培养，节约成本等优点，有的发酵料甚至可以不用经过灭菌直接发酵。

本课题组从1987年开始了微生物降解褐煤的研究，并选育得到一株具有自主知识产权的高效降解真菌(Penicillium s p.P6)。首次阐述了褐煤自然风化与微生物区系演替之间的关系，表明褐煤的风化降解是多种微生物共同作用的结果，在前期主要是放线菌起作用，接着是细菌，在风化程度较高的褐煤中则是真菌起主要作用[5]，基于这一发现课题组研究确定了3株菌(放线菌、真菌和细菌各1株)混合培养降解褐煤的工艺技术，大大提高了内蒙古霍林河褐煤经降解后水溶性黄腐酸的产量，并获得发明专利。本研究旨在通过直接从自然界低阶煤中分离得到混合菌群，减少分离、纯化、菌种复配筛选的步骤；此外，对降解产物的特性及对植物生长的效果进行了初步研究，以期直接获得降解低阶煤的微生物组合，为低阶煤的高效开发应用奠定理论及方法基础。

1  材料与方法

1.1 低阶煤来源

分别从低阶煤资源比较丰富的新疆，山西，云南，内蒙古等地采集到12种类型的低阶煤资源(包括褐煤、风化煤)，取样深度为地表以下15～30 cm处，采集到的煤直接粉碎，过50目筛，备用。

1.2 降解菌群的分离

采用LB液体培养基，装入150 mL三角瓶中使液面深度达到约4 cm左右，121 ℃灭菌30 min。将未灭菌的风化煤按液体体积的1%加入到三角瓶中，并以加入单独灭菌的低阶煤为对照，37℃静止培养1周。将从不同低阶煤中富集到的菌群转接到新的150 mL三角瓶中，以单独灭菌的煤代替未灭菌的煤加入到培养基中继续培养一周。按上述方法传代培养至第十代。

1.3 紫外可见分光光度分析

将两种混合微生物降解内蒙古褐煤得到的水溶性部分用6 mol/l的盐酸调节到pH2.0，过夜沉淀后，6000 rpm离心15 min，弃上清，并用蒸馏水洗涤3次。将得到的黄腐酸低温烘干待用。取烘干的黄腐酸固体溶解到去离子水中，选取适当浓度的溶液进行190～1000 nm的波长扫描。

1.4 红外光谱扫描

红外光谱测定采用Thermo Scientific公司NICOLET iN10 MX显微红外光谱仪，制样时将微量样品放置在金刚石窗片表面上压平后测试，测试范围为4000～600 cm-1，分辨率为4 cm-1，每个样品扫描64次[6]。

1.5 两种黄腐酸对生菜发芽的影响

将低温烘干的黄腐酸配成100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg、400 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg的溶液。将生菜种子浸在去离子水中12 h后，置于灭过菌的双层滤纸的培养皿中，每个培养皿25粒种子，每个培养皿中加入5 mL不同浓度的黄腐酸溶液，每个处理4次重复。并以清水作对照，于室温(15～20 ℃)连续培养7 d后每个培养皿中随机取样10棵测定幼苗的茎长、根长、全长，计算根冠比。

1.6 数据处理及分析

数据分析采用SPSS 13.0处理软件，分析方法采用单因素方差分析，显著性水平为5%。

2  结果与分析

2.1 低阶煤降解菌群筛选结果

采用1.2的方法对来源不同的12种低阶煤进行菌群富集(表1)，结果得到具有较好降解能力的菌群3株，编号分别为SL-1、SL-2、NM-1, 其中SL-2不但对风化煤降解效果好，对内蒙褐煤也有很好的降解效果。对于SX-1、SX-2、TLF-1分离到的菌群没有自身低阶煤降解能力，Akesu-1、Akesu-1、YN-1、YN-2在分离前期具有一定的降解自身低阶煤的效果，但继续传代后降解能力有所下降。显微镜镜检的结果表明，降解效果最好的3个菌群(SL-1、SL-2、NM-1)的组成为细菌，其中包括长杆菌、短杆菌、球菌等。由于菌群中含有大量不可培养的微生物，菌群的组成需要进一步用分子生态学的方法鉴定。

表1 低阶煤降解菌群的筛选结果
Tab.1 Bacterial consortium isolated from low-rank coal

注：F0表示加入样品后的发酵液，定义为第0代；F1表示取第0代的发酵液中转接入新的培养基，定义为第1代；Fn表示连续传代10次以上后的发酵液；Fa表示保存的菌群活化后的发酵液；-表示煤样经7 d降解后OD450值小于0.1；+++ 表示煤样经7 d降解后OD450值大于2；+表示煤样经7d降解后OD450值大于0.1小于1；++表示煤样经7d降解后OD450值大于1小于2。

2.2 黄腐酸紫外-可见光光谱扫描

选取降解能力最强的SL-2菌群，在LB液体培养基中添加1%内蒙霍林河褐煤培养7 d后，采用1.3方法对得到的黄腐酸进行紫外-可见光光谱扫描，并与Penicillium s p.P6降解内蒙霍林河褐煤得到的黄腐酸进行比较。结果见图1。

图1 Sl-2和P6降解内蒙褐煤产生的黄腐酸紫外-可见光图谱比较
Fig.1 Ultraviolet - visible absorption spectroscopy of FA from degraded lignite by SL-2 or P6

注：SL：SL-2降解褐煤得到的黄腐酸；NM：Penicillium s p.P6降解得到的黄腐酸。

由图1可以看出，黄腐酸含有共轭双键及含氧官能团，在紫外可见范围内有吸收，吸收从高频到低频依次递减。可以看出SL-2菌群降解得到的黄腐酸其最大吸收峰在216 nm处，而真菌降解得到黄腐酸的最大吸收峰为220 nm，菌群降解褐煤得到的黄腐酸的吸收峰较真菌得到的向左偏移，这可能和黄腐酸中共轭键、芳香环及含氧官能团结构及含量不同有关。

2.3 红外光谱扫描结果

红外光谱是表征腐植酸组成和结构最常用的方法之一，HA的IR图谱有几个明显的特征峰[7]，不同来源的FA在吸收峰的位置或强度上可能有些变化。见表2。

将SL-2菌群降解得到的黄腐酸经酸析后，离心收集，洗涤并低温烘干，对样品进行红外光谱的扫描，结果与Penicillium s p.P6降解得到的黄腐酸进行比较，见图2。

表2 HA 的红外吸收特征峰及其归属
Tab.2 Assignment of wavenumbers to structural groups

注：数据来源于Swift (1996)。

图2 Sl-2和P6降解内蒙褐煤产生的黄腐酸红外吸收光谱比较
Fig 2. FT-IR spectra of FA from degraded lignite by SL-2 or P6

注：A：SL-2降解得到的黄腐酸；B：Penicillium s p.P6降解得到的黄腐酸(数据来源[8])。

首先，SL-2菌群降解褐煤得到的黄腐酸在3430 cm-1、2929 cm-1、1711 cm-1、1614 cm-1、 1416 cm-1、1261 cm-1、1080 cm-1处均有上述表2中典型的吸收峰，但由于煤来源有所不同，得到的结果有些差别。其次，由图2可以看出，不同微生物降解同一种煤得到的黄腐酸其红外光谱也有所不同，主要表现为1400 cm-1左右羟基OH较P6降解得到的黄腐酸振动减弱，1250  cm-1处羧基的-C-O-伸缩振动加强，并且该菌群降解褐煤得到的黄腐酸在1250～1000 cm-1之间振动迅速减弱，而P6降解得到的黄腐酸在1000 cm-1处仍然有强烈的基团振动。

2.3 两种黄腐酸对生菜发芽效果的比较

不同来源的黄腐酸对植物生长的作用效果有所不同，见表3。

对于SL-2降解褐煤得到的黄腐酸，当浓度在0～500 mg/kg时，生菜幼苗茎长、根长、全长均随黄腐酸浓度增加而增加，并在500 mg/kg时达到最大，均表现出显著性差异；但根冠比随黄腐酸浓度的加大而减小，说明在0～500 mg/kg浓度范围内，该黄腐酸对茎的刺激作用大于对根的刺激作用；当浓度为1000 mg/kg时，所测定的生菜的各项指标均比500 mg/kg时小，茎长与500 mg/kg黄腐酸处理相比差别并不显著，与对照相比具有显著性的增加；而根长、全长、根冠比与500 mg/ kg黄腐酸处理显著减少，尤其是根长比对照减小了14.0%，这说明茎生长的最适黄腐酸浓度高于根部生长所需要的黄腐酸浓度，高浓度的黄腐酸对根的伸长起到抑制作用。Penicillium s p.P6降解褐煤得到的黄腐酸(表4)，也表现出各项测定指标先升高后降低的趋势，但浓度有所不同，具体来说当浓度为200 mg/kg时对茎的刺激作用最为明显，对根刺激的最佳作用浓度为400 mg/kg；根生长的最适生长浓度大于茎生长的最适浓度，根冠比也同样证明两种黄腐酸对根和茎生长作用不同。这可能由于两种黄腐酸分别来自不同微生物对褐煤的降解，黄腐酸中所含官能团及生物活性物质的结构及含量有所不同引起的。

表3 SL-2降解褐煤产生的黄腐酸对生菜萌发影响
Tab.3 Effect of FA from degraded lignite by SL-2 on lettuce germination

注：同一列数据中不同字母代表处理间差异达0.05显著水平，下同。

表4 P6降解褐煤产生的黄腐酸对生菜萌发的影响
Tab.4 Effect of FA from degraded lignite by P6 on lettuce germination

3  结论

对不同来源的低阶煤进行菌群分离，结果分离得到3个具有低阶煤降解能力的菌群，避免了单菌分离、筛选、复配的步骤，可直接应用于研究生产中。通过比较，其中降解能力最强的SL-2降解褐煤得到的黄腐酸与真菌P6降解相同来源的褐煤得到的黄腐酸在降解产物的特性与产品效果，结果表明，2种黄腐酸在紫外-可见光光谱扫描、红外光谱的扫描结果有所不同，其中SL-2降解褐煤得到的黄腐酸其紫外-可见光光谱整体向左偏移，而真菌P6降解褐煤得到的黄腐酸的红外光谱在1000cm-1左右有较强吸收峰。在生菜萌发上的效果表明，两种黄腐酸均表现出植物生长调节剂类似物的性质，即低浓度黄腐酸对植物生长起到刺激作用，高浓度的黄腐酸抑制植物的生长。但两种黄腐酸在生菜发芽上的作用方式不同，其中SL-2菌群降解褐煤得到的黄腐酸对根生长刺激的最佳浓度小于对茎生长的作用浓度，而P6降解褐煤得到的黄腐酸则相反。

总之，由于不同微生物对煤的降解机理不同，降解相同的煤得到的产物在官能团的结构及数量上有所不同，生物活性也有所差别。

参考文献

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[ 3 ]Nardi S, Pizzeghello D, Muscolo A, Vianello A. Physiological effects of humic substances on(下转103页)（上接93页）higher plants[J]. Soil Biol Biochem, 2002,34:1527～1536

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[ 7 ]Swift, R.S., Methods of soil analysis: part 3, Chemical methods. SSSA, Madison, WI. 1996

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