海洋与河水中腐植酸组成比较

巴塔哥尼亚(阿根廷)海洋与河水中腐植酸组成比较

Mara del Carmen Scapini. Vctor Hugo Conzonno Vilma Teresa Balzaretti. Alicia Ferna´ndez Cirelli 著

马莉娜1 李  捷2 译

（1 广东工业大学环境学院 广州 510006

2 青岛理工大学环境学院 青岛 266033）

关键词：黄腐酸 腐殖质 激发—发射模型 丘布特河 Engao海湾

Comparison of Marine and River Water Humic Substances in a Patagonian

Environment (Argentina) Ma Lina1, Li Jie2, translate

(1 College of Environment, Guangzhou University of Technology, Guangzhou, 510006

2 College of Environment, Qingdao Technological University, Qingdao, 266033)

Key words: fulvic acid; humic substances; excitation–emission matrices; Chubut River; Engao Bay

有研究表明，河水中的缓冲剂主要是碳酸氢钠，具有较高的溶解氧浓度(饱和值)和较低的可溶解固体总量。

图1 丘布特省(阿根廷)采样点地图
Fig.1 Map of Chubut Province (Argentina) showing locations of sampling stations

Santinelli和Esteves(1993)发现在海水和河水中的浮游植物多数为齿状硅藻和颗粒状的沟链藻，在河口处引起赤潮的则是漏斗状亚历山大藻。关于Enga o海湾和丘布特河的物理化学特性见表1。

表1 Engao海湾和丘布特河水的物理化学性质(取样点表层水)
Tab.1 Physicochemical characteristics of waters (surface water; sampled station)

注：a表示夏季；b表示平均值；n=8；2 years(未发表的资料)。

有关阿根廷水生腐殖质的研究非常有限，但20世纪80年代末对南美洲草原池塘的调查表明，化学特性会影响水体的分布和动力学特征。本研究的目的是比较河水(丘布特河)腐殖质和这条河流所注入的海湾(Enga o海湾)中腐殖质的结构特性，主要采用元素分析、红外光谱、核磁共振氢谱、碳谱、紫外可见吸收光谱、荧光光谱等方法。本课题首次更深入地研究了腐殖质在这些水域扮演的角色及与之相关的问题。

1  材料和方法

1.1 采样

作为材料的样品有：

(1) 腐殖质于丘布特河Dolavon采样点(43°21.10′S，65°43.90′W)由Scapini等(2004)采集，以多种方法分析其结构特性。

(2) 为消除来自河流的淡水影响，Engan˜o海湾的采样点(43°17′56″S ，65°01′26″W)设在海浪最高的地方。采样限于离河口4公里之内。在2003年12月到2004年3月之间的两周内，取海洋表面的部分海水(约75 L)，然后立即处理。

(3) 对腐植酸采取同样的分析方法，将自然水体用0.45μm滤膜过滤后分光光度法分析。

1.2 海水中腐殖质提取

对腐殖质的分离和提纯使用Mantoura和Riley(1976)的方法。先用Whatman GF/C滤器过滤海水，然后用0.45μm的滤膜(德国Sartorius醋酸纤维素Sartorius 11106)再次过滤，并洗涤至波长200～400 nm范围内(10 cm比色皿)，吸光率为零。记录吸收光谱(200～900 nm，10 cm比色皿)直到确定可溶解有机物(DOM)的含量和其他样品相同为止。然后，将滤液酸化至pH值为2(盐酸)，使用Amberlite XAD-7树脂吸附腐殖质。处理完全部腐殖质后(约580 L)，用蒸馏水漂洗去除腐殖质中的盐分(主要是氯化物)。分离出的腐殖质(约100 mg)，内含甲醇2 mol/L和NH4OH(1:1)，用真空蒸馏器(35 ℃旋转蒸发)去除甲醇和氨，通过离子交换树脂(Amberlite IRA-120，H型)浓缩，最后冷冻干燥。使用相同的方法分离和纯化河水样品。

1.3 腐植酸的分析

在真空浓缩和冻干前，需先确定是否存在腐植酸。取出一部分经过离子交换树脂洗脱的溶液酸化至pH值为1(盐酸1 mol/L)，如果存在腐植酸，将在界面析出。或采用Dean(1972)的测试方法：取100 mL已洗脱的溶液，加入冰醋酸(5 mL)和异戊醇(15 mL)，如果存在腐植酸，将在界面析出。0.45 μm滤膜过滤后的天然水体样品(100 mL)可用相同方法分析。

1.4 元素分析和红外光谱法

用Carlo Erba EA 1108元素分析器和Nicolet Magna 550红外光谱仪(KBr disc)分析提纯后的海水腐殖质的元素组成(C、H、N、O等元素)。

1.5 核磁共振法

使用Bruker Advance 300数码分光计在75.475及300.13 MHz条件下，以5 mm的双向探针测出海水和河水中腐植酸(80 mg/mL，NaOH 0.5 mol/L重水中))以及相应的反式结构的13C和1H谱。13C的光谱参数为：光谱窗口(Sw)300 ppm，脉冲宽度(PW)30°，获得时间(AQ)1.44 s，RD 2 s。数据的处理采用LB 10，zgpg 30软件和Lorentzian-Gaussian卷积法。在溶剂的抑制作用下，核磁共振1H谱参数：NS 128，Sw 16 ppm，Pw 30.0°，AQ 3.9997 s。数据的处理是用LB 0.35，Standar软件Bruker和Lorentzian卷积法。

1.6 紫外吸收和荧光光谱

紫外可见光的吸收光谱是用装了SF 170软件的Metrolab 1700分光光度计和10 cm的石英比色皿测得的。为了避免自熄，丘布特河腐殖质(3.2 mg /L)和Engao海湾腐殖质(6.4 mg/L)在所有的荧光测量中都需要在NaHCO3溶液(150 mg/L)里形成低聚物。常见的激发发射荧光光谱是用Shimadzu RF-5301PC光谱仪(1 cm石英比色皿)测定的。

激发发射模型(EEMs)是用Aminco Bowman系列2与AB2软件冷光光度计4.00版本测定，测量了330～680nm间任一波长的亮度。所有的EEM在任一波长都包括了16497个显著的荧光测量值。每一个样品的EEMs都要减去在相同条件下溶剂的EEMs。用多元曲线交替最小二乘(MCR-ALS)法分析数据。

调整标准溶液和样品的吸光率，使它们在同一激发波长处得到相似的结果。此时，可以假定2种溶液吸收了同样数量的光子。为避免自熄，它们的吸光值均小于0.05(10 mm光程)。测得的数值经过仪器修正后(应用修正系数由制造商提供)减去溶剂的发射光谱值就得到了相同条件下测定的样品和标准溶液的发射光谱值。

2  结果讨论

2.1 酸沉淀

分析腐植酸和黄腐酸时需考虑到水溶解度对pH的影响。将样品置于异戊醇溶液中，加入HCl和冰醋酸后没有沉淀，表明不含腐植酸，只含黄腐酸。这和以往的实验结果相同。众所周知，表层海水中腐殖质的主要成分都是低分子量物质。

2.2 元素组成

Engao海湾和丘布特河黄腐酸的C/N比远小于陆地上的淡水。这是因为在海湾及河流中，浮游生物降解释放蛋白质较多，而陆地生态系统中，占主要地位的是维管束植物的木质素(低蛋白)。

2.3 红外光谱

红外光谱主要用于腐殖质中官能团的定性测定(Bloom和Leenheer1989)，但精确测定是很困难的，因为从多种混合物的红外光谱重复进行吸收，得到了很宽的谱带。

通过测定Engao海湾黄腐酸得到典型的腐植酸光谱，并与丘布特河黄腐酸(图2)的红外光谱进行比较。

表2 不同来源黄腐酸的元素组成
Tab.2 Elemental composition of water fulvic acids from different sources

注：a 浓度：干燥无灰基(丘布特河黄腐酸的灰分为3.2%，Enga o海湾黄腐酸的灰分为8.2%)。

图2 黄腐酸的红外光谱
Fig.2 FTIR spectra of fulvic acids

注：A是丘布特河黄腐酸的光谱；B是Enga o海湾黄腐酸光谱。

由图2可以看出，2个频谱带都在3200～3600 cm-1处转折，表明存在特定的苯酚和醇类的O-H以及胺类和氨基化合物的N-H。河水的光谱在2500 cm-1处因为存在羧羟基而转折，这一情况符合酸在1400～1200 cm-1处的特征吸收光谱线，而海水的光谱在这2个区域里都有低的羧酸吸收值。这表明河水的黄腐酸主要含羧基，海水黄腐酸可能主要含酯类。Buffle(1988)也指出海水黄腐酸存在较低含量的羧酸残留。

在2900 cm-1处，海水黄腐酸(2943 cm-1)和河水黄腐酸(2975 cm-1)的吸收谱线都有明显的转折，证明了脂肪烃的存在。C-H吸收谱线在1450 cm-1和1375 cm-1处的弯曲证明了甲基和亚甲基的存在(甲基典型值)。

烯烃和/或芳香族的C-H在海水黄腐酸的光谱曲线中(3000～3100 cm-1)吸收值比较低，而在河水黄腐酸的光谱中可能和其他物质的吸收曲线重合。两条吸收曲线都在1600 cm-1附近波动，这可能和C=C键的存在有关。在2300 cm-1附近的低吸收强度可能是由于少量带电胺衍生物和氨基酸的存在。

因为黄腐酸中既没有醌类也没有酯类(见核磁共振谱)，所以1720 cm-1处的吸收曲线表示存在羧酸和/或酯类的羰基官能团。在1656 cm-1处的吸收曲线表明含有氨基化合物I的羰基；在1544 cm-1处的吸收曲线表明含有氨基化合物II的C-N，这与海洋黄腐酸中N含量相吻合，这也许是由多肽或蛋白质成分差异所造成的。

红外分析表明Enga o海湾黄腐酸可能含直链脂肪烃，乙醇，酯类物质，酰胺，胺等成分。这与Buffle1988年的结果相符，Buffle指出海洋黄腐酸中通常含有脂肪类似物等重要成分，例如脂肪酸、多糖、氨基糖。

2.4 13C和1H核磁共振谱

众所周知，利用核磁共振法测定腐殖质的化学构成是十分重要的。海水和河水黄腐酸13C和1H核磁共振谱见图3。

图3中，典型但低分辨的谱线可能是由于复杂且无重复的结构造成的。通过了解卷积谱(图3)来计算电子综合峰面积官能团中C和H的原子百分比(表3)。这2种黄腐酸的碳谱表现出一定的相似性和差异性。脂肪族官能团的谱线主要是由于碳在 轨道的相互杂交所致，这在2种谱线中都表现明显，说明它们都含脂肪族官能团。

图3 黄腐酸的13C和1H核磁共振谱
Fig.3 13C and 1H NMR spectra of fulvic acids

在60～90 ppm范围内碳氧化合物(乙醚、酒精、碳水化合物)的值在2种谱线中都比较低。这部分虽然小，但却是海洋黄腐酸的第二个优势，这表示之前提取的官能团对海洋黄腐酸中一部分较小的成分起到了重要作用。在90～110 ppm范围内典型的异头糖类的低共振表明，在黄腐酸中都存在这些化合物和/或一种单一结构的物质。

我们观察到的主要区别存在于110～165 ppm范围内，芳香碳和烯碳的特征，以及在165～190 ppm范围内，羧基碳(酸，酯和酰胺)的共振特征。这些共振明显地表现在河水黄腐酸的谱线上，事实上，这也是谱线中第二个波动比较大的地方。此外，此范围内海水黄腐酸的共振谱线低于河水中的结果，这与红外光谱的测定结果相一致。正如Hatcher等(1980)发现的那样，部分海水黄腐酸组成中含芳香烃，但缺乏木质素。丘布特河黄腐酸和萨旺尼河黄腐酸相似，都有芳香性，但是不同于其他地区黄腐酸的核磁共振碳谱。我们得到的海湾和河水黄腐酸的共振谱线中，在190～230 ppm范围内，都没有明显表现出醛和酮的C=O的典型共振态。这表明，在红外光谱中检测出的羰基官能团可能是以羧酸和/或羧酸衍生物(酯和/或酰胺)的形态存在。

氢谱的结果和碳谱的结果相一致。2种共振谱线都主要受脂肪族质子影响。芳香族质子对海洋黄腐酸谱线的影响可以忽略。Harvey等(1983)发现海洋黄腐酸的核磁共振谱中没有脂肪族的存在。在氢谱中没有表示木质素和单宁残留存在的6.8 ppm的峰值(芳香族的H接近苯酚和含甲氧基官能团)。

Big Soda湖的黄腐酸含有较高的脂肪族碳，较低的芳香族碳；而Engao海湾和丘布特河黄腐酸的共振谱线与Big Soda湖里黄腐酸的共振谱线相似。相比之下，萨旺尼河黄腐酸含较高的酮和芳香族碳。Big Soda湖的黄腐酸主要来源于水中浮游生物的降解，而萨旺尼河黄腐酸主要来自土壤中植物的腐化。这表明，本研究的2种黄腐酸都是水生起源。众所周知，海水腐殖质的主要来源是浮游生物/细菌的分泌和降解(水生来源)，对于河水腐植酸，Spitzy和Leenheer(1988)认为，腐植酸最初来源于河水流过的湖泊和水库。

2.5 紫外可见吸收光谱

紫外可见光谱一般分为3个部分：真空紫外线(100～200 nm)，紫外线(200～400 nm)和可见光(400～800 nm)。在分析腐殖质时真空紫外线不起作用，因为在这一范围内，将腐殖质溶于水及其他大多数溶剂中都会有强烈的吸收。

图4 两种黄腐酸的紫外可见吸收光谱
Fig.4 UV-Visible absorption spectra of fulvic acids from Enga o Bay and Chubut River

腐殖质在紫外线范围内的吸收是由苯环上的π电子在不同角度和不同取代物的激发产生的。由于发光团的种类多、浓度未知而且不易分辨，因而腐殖质的紫外光谱分析非常困难。由于在整个波长范围内的吸收光谱没有特征点，通常选取特定的光谱值测量(如254 nm)。此外，腐殖质的光吸收可能呈指数方式减少：

式中，r表示参考波长，l表示路径长度。

光谱斜率系数(S)用来对比不同的环境条件，作为参数，表示一种波长下的光吸收效率。它跟发光团的性质有关，是发光团的变化指标。本研究中，S取决于Enga o海湾自然海水中黄腐酸(经0.45μm滤膜过滤)的紫外吸收光谱，并与丘布特河黄腐酸的光谱做比较。通过绘制250～400 nm范围内ln(a)对λ的标准曲线，并利用线性回归的方法确定了S。得到结果为18×10-3nm-1，标准偏差为0.3×10-3nm-1，这和丘布特河黄腐酸的S值非常相似(即16×10-3nm-1，标准偏差0.3×10-3nm-1，Scapini等2008)。

Blough和Del Vecchio(2002)指出S值随着分子量和芳香性的减少而增加，而芳香性的减少则是因为缺乏延伸的芳环结构。本研究中黄腐酸的S值高于腐植酸的，这说明这2种黄腐酸都是低分子量，没有延伸的芳环结构。同时，也表明丘布特河黄腐酸只有很少一部分来自土壤，Enga o海湾黄腐酸中的土壤来源则更少。

Peuravuori和Pihlaja(1997)通过一个方程式把系数E2/E3(250和365 nm处的吸光率)和自然水体表面腐殖性溶解物的芳香性(芳香族碳的百分数)联系起来：芳香性=52.509-6.78 E2/E3。把紫外光谱上的值代入方程中，算出Enga o海湾黄腐酸的芳香性是5.5(E2/E3=6.9)，低于丘布特河黄腐酸的芳香性(芳香性是21，E2/E3=4.7)。

2个芳香值都符合核磁共振碳谱得出的芳香族碳百分比。显而易见，从吸收光谱获得的结果和用其他方法得出的结论是一致的。

2.6 荧光光谱

许多研究探讨了腐殖质固有的荧光光谱性能，目的是通过这种高敏感度和不破坏性质的方法得到腐殖质的分子结构。产生荧光是由于芳香族化合物，但脂肪族，棕榈酸和硬脂酸盐也产生荧光。在这项研究中，荧光性质的研究包括激发发射模型和量子产量的测量。

纯净的简单化合物的激发光谱和发射光谱非常相似，荧光发射的最大值与激发波长无关。然而对于腐殖质来说这是不适用的，腐殖质的激发光谱不同于发射光谱，荧光发射的最大值取决于激发波长。用EEMs获得荧光团存在和分类的信息比传统的荧光方法要好，因为它们是与波长无关的测量值。

我们分别获得了Enga o海湾和丘布特河腐殖质的EEMs，最大荧光值(激发最大值/发射最大值)与波长无关，来自于对发射波长和激发波长平面图的比较(图5)。

海水和河水黄腐酸在同一区域显示了最大的荧光强度，丘布特河黄腐酸的激发最大值/发射最大值为220～260 nm/400～450 nm，Engao海湾黄腐酸的激发最大值/发射最大值为260～280 nm/420～450 nm。2种黄腐酸显示了相似的发射波长和激发波长。海水黄腐酸在波长变大时出现轻微的转变，荧光强度变小。而丘布特河黄腐酸在紫外可见光范围内吸收较低。

Coble(1996)和De Souza Sierra等(2005)提到了2个腐殖质类似物荧光团和2种蛋白质类似物荧光团(酪氨酸和色氨酸类似物)。他们还描述了一种特殊的类似海洋腐殖质的荧光团。表4列出了我们研究的黄腐酸取得最大荧光值的激发/发射波长范围，Coble’s(1996)的论文中也记录了同样的峰值。

图5 黄腐酸激发发射模型平面图
Fig.5 Contour plots of excitation emission matrices of fulvic acids from (a) Chubut River and (b) Engan˜o Bay (intensity in arbitrary units)

表4 黄腐酸在最大荧光强度处激发发射波长列表
Tab.4 Names and Excitation/Emission wavelength range at maxima fluorescence intensity of peaks from different sources

注：a 表示Coble在1996年的研究结果。

海水和河水黄腐酸虽然有很大的不同，但他们有着相似的激发最大值/发射最大值，即峰值A(激发最大值/发射最大值为250～260 nm/380～480 nm)。峰值A处的荧光团是海水和河水黄腐酸的主要组成。为了验证其他荧光团的存在和/或重要性，将得到的曲线用多元曲线分辨率交替最小二乘法(MCR-ALS)分析。对于海水黄腐酸，用一种成分解释全部光谱94.6%的变化，拟合误差为23.5%，符合平均记录的信号；而用两种成分解释光谱94.6%的变化，拟合误差为19.5%。对于丘布特河黄腐酸，用一种成分解释全部光谱98.1%的变化，拟合误差为13.5%，而用两种成分解释光谱98.1%的变化，拟合误差为10.2%。这些结果表明，用2个组成部分描述2种黄腐酸是可行的：一个主要组成部分的约占98%，而次要组成部分为1%～2%。2种黄腐酸主要组成部分的激发最大值/发射最大值在峰值范围内都是下降的，尽管海水黄腐酸的激发范围里出现一个轻微变红，发射亮度变暗的转折，但2种黄腐酸次要组成部分的性质也是相似的：在峰值A和C处的图像轻微转移到长波长处。以往的研究支持占优势的A类型荧光团。

基于对自然界黄腐酸和腐植酸的研究及相关文献，De Souza Sierra等人(2005)发现忽略腐殖质来源，峰值A和C是一直存在的。黄腐酸强烈荧光的范围是在激发最大值/发射最大值为260 nm/460 nm左右，次强烈的范围是激发最大值/发射最大值为310 nm/440 nm。对于腐植酸，这2个范围分别是260 nm/525 nm和360 nm/520 nm。这进一步证明了本次研究的腐殖质中主要含黄腐酸，并与用其他方法得到的结论相一致。

在EEMs中，峰值C的贡献是很小的，几乎可以忽略。峰值C被认为主要受木质素衍生物的影响，而木质素在本次研究的腐殖质中含量非常低(见吸收光谱)。

Coble(1996)在缅因州海湾和Coble等(1998)在高辐射贫营养海洋环境中发现，EEMs的峰值C都不明显以至于难以分辨。他们把这些发现归因于表层海水中低有机质含量和太阳高照射地区的光降解，产生了只在低于300 nm范围内受激发的剩余荧光团。Enga o海湾黄腐酸光谱中典型的海洋腐殖质类似物的峰值M并不明显。这和之前Coble提出的高辐射贫营养海洋环境的类型一致。据此，我们猜测本次实验水样中的黄腐酸可能受辐射影响显著。

在对黄腐酸的研究中，没有显示出蛋白质类似物的荧光性。光谱信号与酪氨酸和/或色氨酸及其芳香性有关。因而可以认为，用元素分析法和红外光谱检测法分析Engao海湾黄腐酸蛋白质成分，主要起作用的是脂肪族化合物。为了更好地了解腐植酸的荧光性，个别化合物，如羟基酸和其他替代的酚醛树脂，一直在研究中，但是荧光性物质的结构仍然是一个开放性问题。有文献指出萤光子在较长波长处发射产生荧光，随着萤光子的退化和衰老，线性结合或者某些特定功能的官能团(例如羧基，硝基以及芳香族化合物的羟基)增加。此外，把在低波长处发射的荧光子归入到最小的结构；但也有很多人强调，腐殖质类似物的荧光性源自混合荧光团，它们的数量和个体性质可能永远无法了解。而且，“溶解在自然水体中的有机物质荧光团的准确特性是未知的”，“腐殖质的荧光子是否主要来自于腐植酸的荧光性，这也是一个没有答案的问题”。

2.7 结构特性和环境影响

采用不同的分析方法分析两种黄腐酸得到一致的结论，它们的结构相似，但有所差异。最重要的相似之处在于它们都有高的直链脂肪碳含量和氧化的脂肪族官能团。Buffle(1988)指出河水腐殖质和海水腐殖质的性质相似，两者都源于浮游生物的降解。因此，丘布特河和Engao海湾黄腐酸的相似性支持了丘布特河黄腐酸的水生起源以及之前工作的结论。

上述实验结果有助于我们做出一些其在水体利用和环境影响方面的推测：诸如滤器堵塞或贝类中的藻毒素等。

腐殖质可以增加生物产量和海洋甲藻的增长速度。早期的研究表明，海洋甲藻和硅藻生长速度的增加取决于腐殖质的浓度，这种刺激作用明显不受营养物浓度的影响，而是取决于螯合进程以及对藻类细胞的新陈代谢的刺激。此外，腐植酸可刺激甲藻的增长，而黄腐酸则可促进硅藻的繁殖，这些结果对于Enga o海湾以黄腐酸为主的腐殖质来说是有益的。

今后研究将集中论证这些假设，实验水样在干燥期采集，特别是在极端的气候条件下，像雨水径流这样的意外事件会把黄腐酸带入河里和海湾，可能会改变腐殖质的构成，特性和影响。

3  结论

致谢和参考文献(略)

译自：Aquatic Sciences，2010，72:1～12。

低碳科普知识(二)

碳汇 一般是指从空气中清除CO2的过程、活动、机制，主要是指森林吸收并储存CO2的多少，或者说是森林吸收并储存CO2的能力。《联合国气候变化框架公约》(UNFCCC)的《京都议定书》于1997年在日本京都召开的UNFCCC缔约方大会第三次会议上达成。它包含除了UNFCCC之外法律上所需承担的义务。议定书附件B中包括的各国同意减少人为温室气体的排放量，在2008-2012年的第一承诺期内排放量至少比1990年水平低5%。