腐植酸在铜生物利用率中的作用

用有机修复剂实时修复被金属污染的土壤：腐植酸在铜生物利用率中的作用

Pedro Soler-Rovira1, Engracia Madejón2, Paula Madejón2, César Plaza1 著

刘洪军3 刘新伟4 译

（1 农业科学研究所环境科学中心，国家研究理事会 西班牙马德里 28006

2 农业生物资源研究所，国家研究理事会 西班牙塞维利亚 41080

3 诸城市农业技术推广服务中心 诸城 262000

4 黄岛区农村经济发展局 青岛 266000）

摘  要：通过测定不同来源的腐植酸与Cu(Ⅱ)的吸附行为，探究腐植酸对土壤中Cu(Ⅱ)生物利用率的影响。不同来源的腐植酸(HA)包括从生物固体堆肥(BI)、风化褐煤(LE)、一种金属污染土壤和用BI或者LE修复的土壤中提取获得。在pH值为5、离子强度为0.1 mol/L时，用电位滴定和Langmuir模型获取要测定的腐植酸络合Cu(Ⅱ)的能力和Cu(Ⅱ)－HA络合物的稳定条件常数。Cu(Ⅱ)吸附能力随着酸性基团的含量，尤其是-COOH、芳香族化合物和腐殖化程度的增加而增加，具体顺序是：BI-HA<BI-修复土壤的HAs<未修复土壤的HA<LE－修复土壤的HAs<LE-HA。而Cu(Ⅱ)-HA络合物的条件稳定常数以相反的顺序增加，这可能是由于增加了螯合效应。与LE相比，BI修复可更有效地降低与土壤中CaCl2结合的铜含量。结果表明，用BI和LE修复金属污染的土壤时，土壤修复系统的pH是最重要的化学影响因子，它控制着Cu(Ⅱ)的溶解度和生物有效性。此外，土壤有机质和腐植酸分子也可能是重要因子。尤其是腐植酸中含N，S和O的酸性官能团形成的结合位点对Cu(Ⅱ)的溶解度和生物有效性起着重要作用。

关键词：生物固体堆肥 腐植酸 Langmuir等温线 风化褐煤 土壤污染 土壤有机质

In Situ Remediation of Metal-contaminated Soils with Organic Amendments:

Role of Humic Acids in Copper Bioavailability

Pedro Soler-Rovira1, Engracia Madejón2, Paula Madejón2, César Plaza1 write

Liu Hongjun3, Liu Xinwei4 translate

(1 Instituto de Ciencias Agrarias, Centro de Ciencias Medioambientales, Consejo Superior de

Investigaciones Científicas, Madrid, Spain, 28006

2 Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, Consejo Superior de

Investigaciones Científicas, Seville, Spain, 41080

3 Center of Agricultural Techniques extension service in Zhucheng, Zhucheng, 262000

4 Bureau of rural economy Develop, Qingdao, 266000)

Abstract: The purposes of this study were to determine the Cu(II) binding behavior of humic acids (HAs) isolated from biosolid compost (BI), leonardite(LE), a metal-contaminated soil, and the soil remediated with either BI or LE in relation to their structural properties, and to explore the role exerted by the HA fractions in controlling soil Cu(II) bioavailability. Potentiometric titrations at pH 5 and ionic strength 0.1 M and the Langmuir model were used to obtain the Cu(II) complexing capacity of the HAs examined and the conditional stability constant of the Cu(II)–HA complexes. The Cu(II) complexing capacity increased as the content of acidic ligands, especially COOH groups, aromaticity, and humification degree increased, following the order BI-HA<BI-amended soil HAs<unamended soil HA<LE-amended soil HAs<LE-HA. In contrast, the conditional stability constant of Cu(II)–HA complexes increased in the opposite order, probably due to an increased chelating effect. Compared to LE, amendment with BI was slightly more effective in decreasing soil CaCl2-extractable Cu content. The results obtained suggested that the pH of the soil amendment system is the most important chemical property governing Cu(II) solubility and bioavailability in metal-contaminated soils remediated with BI and LE, although soil organic matter and the HA fraction may also be important factors. In particular, binding sites formed by N, S, and O containing acidic functional moieties in HAs may play an important role in the Cu(II) behavior.

Key words: biosolid compost; humic acids; Langmuir isotherm; leonardite; soil contamination; soil organic matter

世界上很多地区，工业、采矿和农业活动已经造成了严重的土壤金属污染。金属过量累积可能导致植物毒性、微生物活动受限，影响土壤功能和危害周边环境等问题。目前，实时应用有机修复剂稳定土壤中的金属是降低土壤金属污染的修复方法之一。该方法通过有机质结合金属，降低它们溶解性、生物有效性和迁移率，促进植物自身生长能力的提高。

腐植酸(HAs)包含修复剂有机质和已修复土壤混合物的主要成分。已知金属－腐植酸的络合作用可控制金属活性，包括通过降低其水溶性来来降低其生物有效性。因此，腐植酸的含量和性质使其在有机修复剂成功应用于金属污染的土壤修复中起着重要作用。

虽然在土壤有机质和天然腐殖质的有机修复剂成分和结构特征已经被广泛的调查研究，但是最近十年，只有少量的研究涉及到它们的金属结合特性。这些调查的结果表明，除了特殊情况外，有机修复剂，例如污水污泥，城市固体废物，和粪肥，其应用效果一般取决于土壤腐植酸含量，主要是降低它们与金属离子的结合能力和亲和力。

本研究的目的是：(1) 测定Cu(II)络合能力，以及与两种有机修复剂、生物固体堆肥(BI)和风化褐煤(LE)、一种金属污染土壤、用BI或者LE修复的土壤中分离出的腐植酸分子的亲和力；(2) 探讨Cu(II)结合性能和腐植酸分子的结构特性之间的关系；(3) 通过研究Cu(II)生物有效性、土壤、土壤腐植酸属性之间的关系，来评价腐植酸对控制Cu(II)在有机修复剂修复的金属污染土壤中行为的实际作用。

1  材料和方法

1.1 研究区和试验设计

本研究地点位于Guadiamar河的右(西)边(37°26′N，06°12′W，西班牙西南部)，该地区受到了世界上最大的采矿尾渣溢出事件的严重影响。1998年4月，靠近Aznalcóllar大坝的坍塌导致600万立方米的酸水和有毒泥浆泄漏，其中含有大量的S和金属(Fe、Zn、Pb、As、Cu、Sb、Co、Tl、Bi、Cd、Ag、Hg和Se)，淹没了数千公顷的农田和湿地。在泄漏之后，清理工作挖除了有毒泥浆和表层15cm的土壤。

2002年10月进行田间试验设计。小区处理包括：未修复的土壤对照(S)，施用BI 30吨/公顷/年，施用LE25吨/公顷/年和甜菜石灰10吨/公顷/年(SL)。修复剂连续施用两年(2002年10月和2003年10月)并对土壤表层15cm进行旋耕。在2005年10月，将每个小区分为2个。每个小区的一半在接下来的两年中不进行修复(BIS2和LES2)，而另一半继续进行同样的修复处理(BIS4和LES4)，每个小区在最后一次施用修复剂大约一年后采集土样。每个土壤样品为从4个地点收集的12个表层土壤(深度为0～15 cm)样品的混合土壤。

1.2 土壤分析

土样风干，压碎并过2 mm筛。土壤pH用1 mol/L的KCl 1∶2.5进行测定。用重铬酸盐氧化法对0.5 mm的表层土样进行总有机碳含量的测定，并用(NH4)2Fe(SO4)2滴定。总萃取碳含量的测定使用0.5 mm的表层土样，0.1 mol/L Na4P2O7作为萃取剂，样品与萃取剂比例为1∶10，采用TOC－VE岛津氏分析仪进行萃取。萃取出的样品用硫酸进行酸化以使腐植酸沉淀，酸化的上层清液中碳含量用TOC－VE岛津氏分析仪测定。腐植酸的碳含量测定是从总萃取碳中减去酸性上层清液中的碳含量。CaCl2结合的铜含量通过0.01 mol/L CaCl2土壤提取液耦合等离子光学发射光谱测定，提取后，土壤与溶液的比为1∶10。

1.3 腐植酸的分离和表征

通过传统的方法从BI，LE和土壤样品中分离腐植酸，该过程包括用NaP2O7和NaOH进行碱性提取，酸化沉淀，水洗和透析。腐植酸的化学特征的测定，每个样品3次重复，具体如下：湿度的测定采用105℃整夜加热，灰分含量的测定通过550 ℃整夜灼烧。C、H、N和S含量的测定用LECOCHNS-932元素分析仪，氧的含量通过差分计算；羧基官能团的评价通过在pH=8时，直接微量滴定法，酚羟基官能团是pH在8和10之间两倍变化测定。总的酸度通过添加物法来计算。

腐植酸溶液在浓度为100 mg/L，pH=7，离子强度为0.1 mol/L时，分别在280 nm、665 nm、465 nm时用Shimadzu UV-1603光谱仪记录其吸光度分别测定在280nm时的吸光度和E4/E6比。

腐植酸的傅立叶变换红外(FTIR)光谱在4000～400 cm-1通过在真空下压缩1 mg腐植酸和400 mg干溴化钾的混合物获得的球团的测定来生成。使用Shimadzu FTIR-8400分光光度计，在2 cm-1的分辨率和64次扫描的情况下得到光谱。

1.4 腐植酸结合Cu(Ⅱ)属性的测定

60 mL HA溶液，浓度为0.5 g/L，pH=5，离子强度0.1 mol/L，用0.01 mol/L Cu(NO3)2滴定，采用装有梅特勒特莱德DG111-SC pH电极和Orion 94-29Cu(Ⅱ)离子选择电极的梅特勒特莱德DL77的自动滴定仪滴定。在温度保持在25℃，并通过添加0.01mol/L KOH使pH保持为5，持续不断的搅拌溶液。将滴定标准液分成0.002～0.2 mL不等的小份以获得小于3mV的电极电势变化。在电势平均变化小于0.2 mV/min时记录所显示的电极电势。读数最短间隔时间为1 min，即达到平衡的最短时间为1分钟。所有的滴定标准液做3次重复。滴定之前用标准缓冲液在pH＝4和pH＝7时矫正pH电极，Cu(Ⅱ)校正曲线通过向pH＝5、离子强度为0.1 mol/L的空白溶液(不含HA)中添加0.01mol/L Cu(NO3)2来制备。

用Langmuir模型来定量分析腐植酸络合Cu(Ⅱ)的能力和Cu(Ⅱ)-HA络合物的条件稳定常数：

式中，v表示结合程度或者形成功能，[ML]表示金属络合浓度(mol/L)，(HA)total是腐植酸的总浓度(kg/L)，CC是腐植酸的最大结合能力(mol/ kg)，K是结合常数(L/mol)，[M]是金属的平衡自由浓度(mol/L)。通过从总金属浓度中减去自由金属浓度来计算每一个滴定点的金属络合浓度。K和CC值通过下面方程的线性化后的线性回归获得：

1.5 统计分析

用皮尔森相关分析来检测CC和logK参数以及腐植酸化学属性之间潜在的线性关系。采用线性回归分析来探讨土壤CaCl2提取Cu的含量、土壤及土壤－腐植酸属性之间的关系。所有的计算采用计算机程序Statistica4.0进行。

2  结果和讨论

2.1 修复剂和土壤的化学属性

与先前对本研究所用物质的报道数据一致，BI、LE和SL的pH值分别是6.9±0.03、6.08±0.07和9.04±0.08；BI中总有机碳的含量是185±12 g/kg,LE中为289±4 g/kg，SL中为67±16 g/kg；总铜含量BI中为121±6 mg/kg，LE中为28.2±2.4 mg/kg，SL中为51±8 mg/ kg。对照土壤表现出：强酸性(pH＝3.52)；总有机碳、总可提取碳和腐植酸碳含量分别为9.9 g/ kg、4.7 g/kg、2.5 g/kg，和中度高水平的总铜(119 mg/kg)和CaCl2提取铜(2.72 mg/kg)。

与对照土壤相比，修复土壤具有较高的pH(其中BIS2、BIS4、LES2和LES4的pH值分别为：5.53、6.48、4.08和5.36)，尤其是在最高修复率时。对于BI处理这可能是由于在SL－LE混合物中SL提供了碳酸钙，基础阳离子的含量较高，并有良好的缓冲能力。总有机碳、总可提取碳和腐植酸碳含量随着BI尤其是LE的使用而有显著增加(BIS2的施用量为：18.5 g/kg、5.9 g/kg和2.8 g/kg；BIS4的施用量为19.1 g/kg、5.5 g/kg和3.4 g/kg；LES2的施用量为21.5 mg/kg、9.0 mg/kg和4.0 mg/kg；LES4的施用量为34.9 mg/ kg、26.1 mg/kg和7.8 mg/kg)。这两种材料导致了CaCl2可提取的铜含量显著降低，随着修复率的增加和在BI修复的土壤中这种现象更加明显，其中BIS2、BIS4、LES2和LES4处理中的CaCl2可提取的铜含量分别为：0.28 mg/kg、0.16 mg/kg、1.01 mg/kg和0.26 mg/kg。根据现有的科技文献可知，CaCl2可提取金属含量提供了一个土壤溶液和可交换金属库的测量方法，而且一般情况下被认为是测量金属在土壤中的溶解性、生物有效性和迁移性的一个可靠指示剂。

2.2 腐植酸的化学属性

元素和官能团的分析表明，在从BI、LE和天然土壤中分离出的腐植酸之间有显著差异(表1和表2)。与S-HA相比，BI-HA的氮和硫含量较高，C/H和C/N较低，COOH和酚羟基的含量较低。这些结果是由于在Bi-HA分子中蛋白质分解产物与污水污泥中的含硫表面活性剂残留物的结合，而且与自然土壤中的HA相比，在饱和脂肪结构(具有低的C/H)中存在大量新形成的腐植类物质。而与S-HA相比， LE-HA有较低的H和N含量，较高的CO和酸性官能团，以及更高含量的C和S及C/N和C/H。根据Olivella(2002)的研究结果可知，在LE中氧化的硫，例如，硫磺酸和硫酸盐代表了有机硫的主要形式。

表1 各种来源HA样品的元素组成和原子比例a
Tab.1 Elemental composition and atomic ratios of humic acids (HAs) isolated from BI, LE and natural soil

注：a标准误差小于1。

表2 各种来源HA样品酸性功能团含量(±标准误差)，280 nm处的特定吸光系数(ε)和E4/E6比例
Tab.2 Acidic functional group contents (±standard errors), specific absorptivity at 280 nm(e), and
E4/E6 ratio of humic acids (HAs) isolated from BI, LE and natural soil

注：a标准误小于1。

BI的施用，尤其是在较高浓度水平时，增加了修复土壤中腐植酸中H、N、S的含量，降低了O、酸性官能团的含量和C/N及C/H。与之相反，LE的应用影响土壤HA的组成，主要是通过降低了H和N的含量，增加了C和S的含量以及C/N和C/H。

腐植酸在280 nm时的标准吸光度的顺序如下：BI-HA<BI修复土壤的 HAs<S˜HA<LE修复土壤的HAs<LE-HA，而E4/E6比值的顺序与其相反(表2)。Chen(1977)和Chin(1994)的研究结果表明，随着腐植酸物质的分子大小、芳香度和腐植化程度的增加，标准吸光度增加，而E4/E6比值下降。

BI-HA，尤其是LE-HA的傅立叶变换红外光谱不同于S-HA(图1)。BI-HA的傅立叶变换红外光谱在2925、2850和 1450 cm-1(脂肪族C-H),1540 cm-1(酰胺基的N-H键变形和C=N键拉伸)和1040 cm-1(多糖或者类多糖物质的C-O键的拉伸)时有较高强度的吸收谱带，而在1720 cm-1(羧基和酮类的C=O键)、1240 cm-1(羧基的C-O键拉伸和O-H键变形，酚醚类的C-O键的拉伸)时有较低强度的吸收谱带。与此相反，与S-HA相比，LE-HA的傅立叶变换红外光谱在2925 cm-1和2850 cm-1时有较低强度的吸收谱带，在1720 cm-1时出现一个更强的吸收谱带峰，而在1540 cm-1和1450 cm-1时无吸收谱带。

S-HA与类似条件下的其他研究的结果一致，从BI修复土壤中分离出的腐植酸的傅立叶变换红外光谱表明：(1) 吸收谱带相对强度的略微增加是由于脂肪族C-H键的拉伸(在2900 cm-1区域)、酰胺(大约1540 cm-1处)和多糖类结构(1040 cm-1)的N-H键变形、C=N键拉伸；(2) 吸收谱带的相对强度的略微增加是由于羧基的C=O键的拉伸(1720 cm-1)、酚羟基的O-H键的变形和C-O键的拉伸(在大约1390 cm-1处)(图1)。反之，从LE修复土壤中分离的腐植酸的光谱不同于S－HA，这是因为：(1) 更显著的红外吸收表现在羟基C=O键的拉伸(1720 cm-1)、酚羟基O-H键的变形和C-O键的拉伸(1390 cm-1)、羧基C-O键的拉伸和O-H键的变形以及芳基醚的C-O键的拉伸(1240 cm-1)和类多糖体C-O键的拉伸(1040 cm-1)；(2) 较小强度吸光度是由于脂肪族C-H(2900 cm-1区域和1450 cm-1)和N-H键的变形，以及酰胺基C=N键的拉伸(大约1540 cm-1处)(图1)。

图1 各种来源的HA傅立叶变换红外光谱
Fig.1 Fourier transform infrared spectra of
humic acids (HAs) isolated from BI, LE and natural soil

2.3 腐植酸Cu(Ⅱ)络合能力和Cu(Ⅱ)腐植酸复合物的条件稳定常数

图2给出从BI、LE、未修复和已修复土壤中分离出的HAs结合Cu(Ⅱ)的等温线，而从表3中可以看出，采用线性化朗格缪尔方程对实验数据进行线性回归所得的相应的CC和logK值。较小的残余平方和与估计值标准差以及较大的确定系数表明，朗格缪尔模型非常适合于该实验的滴定数据(表3)。

图2 各种来源的HA与Cu(Ⅱ)结合的等温线
Fig.2 Isotherms for Cu(II) binding by humic acids isolated from BI, LE, S, BIS2, BIS4, LES2 and LES4, respectively

注：[M]是溶液中Cu(Ⅱ)的浓度，ν是结合程度[即溶液中总腐植酸浓度中腐植酸结合Cu(Ⅱ)的浓度]。

表3 各种来源的HA样品与Cu(Ⅱ)结合的络合能力(CC)、稳定常数(logK)、离差平方和(RSS)、确定系数(r2)和标准估计误差(SEE)a
Tab.3 Complexing capacity(CC), stability constant(log K), residual sum of squares(RSS), coefficient of determination(r2), and standard error of the estimate(SEE) for Cu(II) binding by humic acids(HAs) isolated from BI, LE, S, BIS2, BIS4, LES2 and LES4, respectively

注：a 每一种腐植酸滴定数据3个集合(3次重复)的平均值(±标准误差)。

实验表明，不同来源的腐植酸结合Cu(Ⅱ)的性质存在显著差异。尤其是S-HA Cu(Ⅱ)络合能力大于BI-HA，小于LE-HA。BI的施用导致土壤腐植酸Cu(Ⅱ)结合点位的略微减少，而用LE修复却引起了较大的增加。与Cu(Ⅱ)结合能力相反，BI-HA的Cu(Ⅱ)复合物条件稳定常数(log K)高于S-HA，稍高于LE-HA。与未修复土壤的腐植酸相比，BI修复土壤的腐植酸logK有所增加，而LE修复土壤的则有所降低。

Cu(Ⅱ)络合能力与C/N(P<0.05)，总酸度(P<0.01)，羧基和酚羟基含量(分别为P<0.01和P<0.05)和ε(P<0.05)成正比，而与H和N含量(P<0.01)成反比(表4)。这些结果表明腐植酸Cu(Ⅱ)络合能力与酸性配位基，尤其是羧基官能团的含量有关。这是由于该类配位基不同于酚羟基，在pH＝5时可以被高度的去质子化。该结果也说明了与脂肪族或者是腐植化程度不高的官能团相比，芳香性的或者是腐植化程度很好的官能团更容易提供Cu(Ⅱ)结合位点，这也证明了以前对于从各种有机修复剂分离的腐植酸与从相应的未修复土壤和修复土壤分离出的腐植酸相比较的研究结果。

与Cu(Ⅱ)络合能力的结果相反，log K与总酸度(P<0.01)，羧基和酚羟基含量(分别为P<0.01和P<0.05)和ε(P<0.05)成反比，而与H和N含量(P<0.01)成正比(表4)。结果表明，Cu(Ⅱ)-HA复合物的稳定条件常数随着结合位点的数量、腐植酸芳香化和腐植化程度的增加而降低，这可能是由于增加了腐植酸的分子内和分子间的斥力以及分子刚性而降低了螯合作用(即，从螯合到单一晶体有增加的趋势)。

表4 Cu(Ⅱ)络合能力(CC)和稳定常数(logK)与腐植酸的元素含量、原子比例、酸性功能团含量、在280 nm处的标准吸光系数(ε)和E4/E6比之间的相关系数
Tab.4 Correlation coefficients of Cu(II) complexing capacity (CC) and stability constant (logK) with elemental contents, atomic ratios, acidic functional group contents, specific absorptivity at 280 nm(ε), and E4/E6 ratio of humic acids isolated from BI, LE, unamended soil, soils amended with biosolid compost,
and soils amended with leonardite.

注：*在0.05概率水平下显著；**在0.01概率水平下显著。

2.4 CaCl2可提取铜与金属污染土壤和土壤腐植酸化学参数之间的关系

在土壤和土壤腐植酸的化学参数中，只有土壤pH值在0.1水平下与CaCl2可提取铜含量有显著相关(表5)。表明土壤修复系统的pH是调控Cu(Ⅱ)溶解性和生物有效性的最重要的化学参数，这与许多研究的结果一致。金属溶解性随着pH的升高而降低，这是因为金属被氢氧化物沉淀并且能优先结合固体土壤成分中的离子官能团。

虽然在P<0.1时没有表现出显著相关性，在一个总的土壤质量基础上，CaCl2可提取铜的平均水平随着土壤中总有机碳和腐植酸碳含量，H、N、S、O和酸性官能团含量，土壤腐植酸的络合能力的增加而有降低趋势(表5)。这表明土壤有机质和腐植酸在土壤修复系统中也是控制Cu(Ⅱ)溶解性、生物有效性和迁移性的重要因子。尤其是腐植酸中含有N、S和O酸性官能团部分可能在Cu(Ⅱ)的络合行为中发挥重要作用。相关文献证明腐植酸物质的金属结合中不仅有O参与，而且也有N和S，通过O、N和S的组合形成了一个强的结合位点。本文所述元素和官能团分析结果表明，在用BI修复的土壤中，与S和O相比，N可能发挥了较为明显的作用，而在用LE修复的土壤中含S和含O酸性位点可能相对更重要。

表5 未修复金属污染土壤和用BI及LE修复的土壤中的CaCl2可提取Cu含量与土壤和土壤腐植酸中化学参数的相关系数(r)
Tab.5 Correlation coefficients (r) of CaCl2-extractable Cu content of metal-contaminated soils unamended and amended with biosolid compost and leonardite with chemical properties of soils and soil humic acids

注：(1) aTOC，总有机碳；TEC，总可提取碳；HAC，腐植酸碳；T，在总土壤质量基础上的含量；ε，280nm时的特定吸光系数；CC，Cu(Ⅱ)络合能力；logK，Cu(Ⅱ)的稳定常数。
(2) *在0.1概率水平下显著。

参考文献(略)

译自：Chemosphere，2010，79: 844～849。