乳酸脱氢酶及其辅酶Ⅰ的作用

【实验目的】

1．加深理解结合酶的概念与作用特点。

2．掌握乳酸脱氢酶及其辅酶Ⅰ的作用机制。

【实验原理】

乳酸脱氢酶由酶蛋白和辅酶Ⅰ组成，两者单独存在时，无催化活性，必须共同存在组成全酶才起作用。乳酸脱氢酶广泛存在于各种组织细胞，在代谢过程中有重要意义，它可逆地催化乳酸脱氢形成丙酮酸或丙酮酸接受氢生成乳酸，反应中由辅酶Ⅰ（NAD＋）起传递氢的作用。乳酸脱氢酶属于不需氧脱氢酶，不能直接将氢交给氧，反应中生成的还原型辅酶I，可与其他酶蛋白结合，将氢传给其他的递氢体，通过呼吸链被彻底氧化。

本实验以乳酸为底物。用新鲜的动物肝脏或肌肉组织的粗制提取液，分别制成酶蛋白部分（用白陶土吸附除去辅酶Ⅰ）和辅酶部分（加热破坏酶蛋白），观察两者单独作用及共同作用的情况。实验中为了便于观察，用甲烯兰（美兰）作为受氢体，已知甲烯兰能从还原型黄酶接受氢而由蓝色变成白色（甲烯白）。所以本实验中根据溶液蓝色的消褪情况判断乳酸脱氢反应的发生。

【实验器材】

水浴锅；离心机；离心管；试管；研钵；剪刀；镊子；实验动物（小鼠、大鼠或兔）。

【实验试剂】

1．玻璃砂　充分洗净。

2．0．1MpH7．4磷酸缓冲液　称取Na2HPO411．92g，KH2PO42．18g，加水定容至1升。

3．白陶土　用于吸附辅酶Ⅰ。

4．0．5%KCN液　称取KCN　0．5g，加水溶解成100ml。

5．5%乳酸钠溶液　称取乳酸钠5g，加水溶解成100ml。

6．0．04%甲烯兰液　称取甲烯兰0．04g，加水溶解成100ml。

【实验方法】

1．分别制备酶蛋白提取液及辅酶Ⅰ提取液

（1）除去辅酶Ⅰ的酶蛋白提取液：取新鲜动物肝（或肌肉）组织3g，剪碎放研钵中加玻璃砂约0．5g，白陶土0．5g，加pH　7．4　0．1M磷酸缓冲液8ml，研成细粥状。移入离心管中，以2　000rpm离心5min，倾于另一试管中备用。

（2）辅酶Ⅰ提取液：取蒸馏水10ml于中试管中，加热煮沸。取新鲜的肝（或肌肉）组织3g，剪碎，放入沸水中，继续煮沸10min，为防止水分过多蒸发可加盖。稍冷后倾入乳钵中研细，移入离心管中离心10min，取上清液备用。

2．取试管4只，标明管号，按附表6加样

附表6　四种乳酸脱氢酶催化的反应体系

3．充分混匀，向各管徐徐加人液体石蜡5滴（避免与空气接触），静置试管架上或放37℃水浴15～30min，随时观察并记录各管褪色情况，分析结果。

【注意事项】

1．KCN剧毒，注意安全。

2．乳酸脱氢生成的丙酮酸与KCN结合，防止可逆反应发生。

3．本实验中生成的甲烯白易被空气氧化又转变成甲烯兰，所以在加入液体石蜡后观察褪色时不宜振荡。

（肖建英）