一、细胞核的分离及核酸含量测定
【实验目的】
1．掌握柠檬酸水溶液分离细胞核的方法。
2．了解二苯胺法测定DNA含量的方法。
3．了解地衣酚法测定RNA含量的方法。
【实验原理】
真核生物DNA主要分布在细胞核里，RNA主要分布在细胞质中。用1．5%的柠檬酸水溶液将生物组织制成匀浆，通过差速离心，使比重较大的细胞核从细胞质及一些碎片的悬浮液中沉淀下来。然后经蔗糖梯度离心，除去附着在细胞核表面的细胞质颗粒物质，获得纯净的细胞核。在碱性条件下，细胞核溶解释放DNA。本实验采用二苯胺法测定DNA含量，地衣酚法测定RNA含量。
DNA与强酸共热可分解产生嘌呤碱基，脱氧核糖及脱氧嘧啶核苷酸。脱氧核糖在酸性条件下脱水产生ω－羟基－γ－酮基戊醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。该蓝色化合物在595nm处有最大吸收峰。DNA在40～400μg／ml范围内与吸光度值成正比。
RNA与强酸共热可分解产生嘌呤碱基、核糖及嘧啶核苷酸。核糖脱水生成呋喃醛，后者在Fe3＋催化下，与地衣酚生成鲜绿色化合物。该绿色化合物在660nm处有最大吸收峰。RNA在20～250μg／ml范围内与吸光度值成正比。
【实验器材】
玻璃匀浆器；100目尼龙布；刻度吸管；小天平；水浴锅；分光光度计；离心机；实验动物（小鼠或大鼠）。
【实验试剂】
1．0．85%NaCl溶液 称取NaCl 0．85g，加水溶解成100ml。
2．1．5%柠檬酸溶液 称取柠檬酸15g，用蒸馏水溶解至1 000ml。
3．0．25mol／L蔗糖－1．5%柠檬酸溶液 称取蔗糖8．6g，用1．5%柠檬酸溶液溶解至1 000ml。
4．0．88mol／L蔗糖－1．5%柠檬酸溶液 称取蔗糖30．1g，用1．5%柠檬酸溶液溶解至1 000ml。
5．0．2mol／L Tris－HCl（pH7．5）缓冲溶液 称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）24．2g，加适量蒸馏水溶解，用浓HCl调节pH＝7．5，再用蒸馏水定容至1 000ml。
6．0．05mol／L Tris－HCl（pH7．5）－0．15mol／L NaCl溶液 称取8．7g NaCl，加入0．2mol／L Tris－HCl（pH7．5）缓冲溶液250ml溶解，用蒸馏水稀释至1 000ml。
7．0．02mol／L NaOH溶液 称取NaOH 0．8g，加水溶解成1 000ml。
8．1mol／L KOH溶液 称取KOH 56g，加水溶解成1 000ml。
9．1mol／L过氯酸溶液 量取70%过氯酸8．57ml，加蒸馏水至100ml。
10．5%三氯醋酸溶液 称取三氯醋酸5g，加水溶解成100ml。
11．二苯胺试剂 称取结晶二苯胺1．0g，溶于100ml冰醋酸中，再加2．75ml浓H2SO4，混匀。（所用试剂均要求分析纯以上）。
12．地衣酚试剂 量取100ml浓HCl（比重1．19），加100mg FeCl3和100mg地衣酚（3．5－二羟基甲苯）溶解混匀，储于棕色瓶中。（临用前配制，所用试剂均要求分析纯以上）。
13．DNA标准溶液（0．4mg／ml） 称取40．0mg小牛胸腺DNA，加数滴1mol／L NaOH使之溶解，再加蒸馏水定容至100ml。
14．RNA标准溶液（0．8mg／ml） 称取80．0mg酵母DNA，加数滴1mol／L NaOH使之溶解，再加蒸馏水定容至100ml。
【实验方法】
1．细胞核的分离
（1）取新鲜鼠肝0．5g，用剪刀剪碎，放入匀浆器中，加1．5%柠檬酸溶液4．5ml，研磨制成肝匀浆。
（2）用100目尼龙布过滤于离心管中，3 000rpm离心10min。将上清转移到一试管中，即得细胞质液。向沉淀中加入0．25mol／L蔗糖－1．5%柠檬酸溶液2．5ml，用细玻棒搅拌制成粗核悬液。
（3）向另一离心管中加入0．88mol／L蔗糖－1．5%柠檬酸溶液5．0ml。然后用滴管将粗核悬液转移其上（注意，不能搅动），1 000rpm离心15min。弃上清，保留沉淀。
（4）向沉淀中加入0．05mol／L Tris－HCl（pH7．5）－0．15mol／L NaCl溶液5．0ml，悬浮沉淀，2 000rpm离心10min。弃上清，保留沉淀（细胞核）。
（5）向沉淀中加入0．02mol／L NaOH溶液5．0ml。使细胞核溶解，得到细胞核液。
2．DNA含量测定——二苯胺法
（1）制备DNA水解液：取离心管2支，试管1支，按附表7操作。
附表7 DNA水解液制备方法
100℃水浴10min。然后1号和2号离心管3 000rpm离心5min，上清为DNA水解液，待测DNA。
（2）DNA含量的测定：取试管4支，按附表8操作。
附表8 DNA含量测定方法
混匀，100℃水浴10min。取出试管冷却后，用1号管调零点，测定各管595nm处光吸收值。
（3）DNA含量的计算：按下面公式计算每克肝组织细胞质和细胞核中DNA含量
3．RNA含量测定——地衣酚法
（1）制备RNA水解液：取离心管2支，试管1支，按附表9操作。
表附表9 RNA水解液制备方法
1号和2号离心管3 000rpm离心5min，上清为RNA水解液，待测RNA。
（2）RNA含量的测定：取试管4支，按附表10操作。
附表10 RNA含量测定方法
混匀，100℃水浴10min。取出试管冷却后，用1号管调零点，测定各管660nm处光吸收值。
（3）RNA含量的计算：按下面公式计算每克肝组织细胞质和细胞核中RNA含量
鼠肝的DNA含量约为220μg／100mg组织，RNA含量为900～1 000μg／100mg组织。
【注意事项】
1．RNA及DNA定量比色时，注意勿使比色液外溅，以免损伤仪器及衣物。
2．因地衣酚试剂及二苯胺试剂中含浓酸，比色完毕后废液倒入水道时，必须用大量水冲洗水道，以免腐蚀水道。
二、真核生物基因组DNA的提取及含量测定（苯酚法）
【实验目的】
1．掌握苯酚法制备DNA的原理和方法
2．掌握紫外吸收法测定DNA含量
【实验原理】
真核生物的DNA位于细胞核内，是双链线性分子。DNA提取的主要过程是：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质及其他多糖、脂类等生物大分子。本实验通过蛋白酶K和SDS使蛋白质变性，再用酚／氯仿除去蛋白质，用乙醇沉淀DNA。
核酸分子中含有嘌呤碱基和嘧啶碱基，后两者的共轭双键具有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm处。本实验采用紫外吸收法测定核酸含量。
蛋白质分子中的芳香族氨基酸残基也具有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在280nm处。通过测定A260／A280比值来检测DNA的纯度。DNA的纯度应为1．8左右，RNA的纯度应大于2．0。
【实验器材】
匀浆器；小天平；Ep管；离心机；水浴箱；加样器；紫外分光光度计；实验动物（小鼠或大鼠）。
【实验试剂】
1．DNA提取缓冲液
（1）50mM Tris－HCl（pH 8．0）：称取0．605g Tris，与29．2ml 0．1mol／L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
（2）0．1mol／L EDTA（pH 8．0）：在800ml水中加入37．2g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na·2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH至8．0，然后定容至1L。
（3）0．5%SDS：在90ml水中溶解0．5g SDS，加热至68℃助溶，加入水定容至100ml。
2．RNase（20mg／ml） 称取RNase 20mg溶于1ml蒸馏水中，置于－20℃保存，避免反复冻融。
3．蛋白酶K（20mg／ml） 称取蛋白酶K 25mg，加入1．25ml蛋白酶K溶解液，使之完全溶解后，置于－20℃保存。
4．饱和酚
5．氯仿－异戊醇（24∶1）
6．3．0mol／L NaAc（pH 5．2） 在800ml蒸馏水中溶解408．1g三水NaAc，用冰乙酸调节pH至5．2，加水定容至1L。
7．100%乙醇
8．70%乙醇 量取无水乙醇70ml，加水溶解成100ml。
9．1×TE（pH 8．0） 1mmol／L EDTA in 10mmol／L Tris－HCl（pH 8．0）。
10．无菌水
【实验方法】
1．DNA提取
（1）制备组织匀浆：取新鲜肝组织0．2g，加入DNA提取液1．2ml，制成肝匀浆。
（2）DNA的释放：向匀浆液中加入RNase（20mg／ml），倒入Ep管中，使其终浓度为100μg／ml，37℃保温30min。然后加入浓度为20mg／ml的蛋白酶K 3μl，使其终浓度为50μg／ml，50℃保温2h。
（3）抽提DNA：取一只Ep管，加0．5ml保温液，加0．5ml饱和酚，充分震荡混匀，10 000 rpm离心10min。将上层水相转移到新的Ep管中，加入等体积的氯仿／异戊醇。充分混匀后，10 000rpm离心10min。
将上层水相转移到新的Ep管，加入3．0mol／L的NaAc 50μl，加2～2．5倍体积的无水乙醇，10 000rpm离心10min。小心丢弃上清，向沉淀中加入70%乙醇离心洗涤（10 000rpm离心5min），使沉淀自然干燥。
（4）DNA溶解液制备：向沉淀中加入适量的无菌水或TE溶解沉淀。
2．DNA含量测定和纯度鉴定
（1）取DNA溶解液用三蒸水或TE适量稀释（稀释倍数为300）。
（2）用三蒸水或TE做空白对照调零点，测A260和A280。
（3）按照下列公式计算核酸含量及纯度。
当双链DNA标准溶液浓度为50μg／ml（单链DNA或RNA为40μg／ml），吸收杯光径为1cm时，其吸光度A260＝1．000。则待测DNA或RNA溶液的浓度为：
DNA浓度（μg／μl）＝A260×50×稀释倍数×10－3
RNA浓度（μg／μl）＝A260×40×稀释倍数×10－3
根据浓度计算DNA总量：DNA总量（μg）＝DNA浓度（μg／μl）×体积（μl）
【注意事项】
若DNA的A260／A280＜1．6，说明蛋白质等物质残留过多，需进一步用苯酚／氯仿再抽提及乙醇沉淀。若A260／A280＞2．0，说明RNA残留，此时应加RNase再消化提取。
（田余祥）
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
