血糖含量的测定

一、Folin－ 吴氏法测定血糖

【实验目的】

1．掌握Folin－吴氏法测定血糖的原理和方法

2．了解血糖测定的临床意义

【实验原理】

全血经除蛋白后，滤液中的葡萄糖在碱性条件下，与硫酸铜共热，其蓝色的二价铜离子（Cu2＋）被还原成砖红色的氧化亚铜（Cu＋）沉淀，后者可使磷钼酸还原成钼兰。如与同样处理的标准葡萄糖比色，即可求出血中葡萄糖的含量。

反应式：

【实验器材】

试管；水浴箱；分光光度计；全血样品。

【实验试剂】

1．碱性铜试剂　称取无水碳酸钠40g，溶于100ml蒸馏水中，溶后加酒石酸7．5g，若不溶解可稍加热，冷却后移入1　000ml容量瓶中。另取纯结晶硫酸铜4．5g，溶于200ml蒸馏水中，溶后将此液倒入装上液的容量瓶中，加蒸馏水至1　000ml，摇匀，备用。

2．磷钼酸试剂　取纯钼酸70g，溶于10%NaOH　400ml中，再加Na2WO410g，加蒸馏水至总体积为800ml，加热煮沸30～40min（以除去钼酸中可能存在的氨）冷却后加85%磷酸250ml，加蒸馏水至1　000ml刻度，摇匀，储棕色瓶中。

3．标准葡萄糖液　储存液（1．0ml＝10mg葡萄糖）：准确称取葡萄糖1．0g，用0．25%苯甲酸液溶解，倾入100ml容量瓶，最后加0．25%苯甲酸液至刻度，摇匀，放置冰箱中保存。应用液（1．0ml＝0．025mg葡萄糖）：准确取上述储存液0．5ml，移入200ml容量瓶中，加0．25%苯甲酸液至刻度。

4．0．25%苯甲酸液　称取苯甲酸2．5g，加入煮沸的蒸馏水1　000ml中，使成饱和溶液，冷却后，取上清液备用。

5．10%Na2WO4　称取Na2WO4·2H2O　11．23g，加水溶解成100ml。

6．2／3NH2SO4　称取浓硫酸18．4ml，加水溶解至1　000ml。

【实验方法】

1．除蛋白血滤液的制备　取干试管1支，依次加入蒸馏水3．5ml，血液0．lml，2／3N H2SO40．2ml，10%Na2WO40．2ml，混匀，待有澄清出现后，直接过滤（滤纸不要润湿），收集滤液备用。

2．取试管3支，编号，按附表12操作。

附表12　Folin－吴氏法测定血糖加样步骤

将各管混匀后，用红色滤光片或620nm波长，以空白管调零点，比色，记录光吸收值。

3．血糖含量计算

【注意事项】

1．本法所测得的血糖值，并非是真正的葡萄糖，滤液中还有其他还原物质的干扰（约10%），故结果偏高。

2．血糖测定应在取血后2h内完成，放置过久，葡萄糖易分解，致使结果减低。

3．磷钼酸试剂宜储于棕色瓶中，如出现蓝色，表明试剂本身已被还原，不能再用。

4．碱性铜试剂中如出现氧化亚铜沉淀也不可用。

【临床意义】

此法测定血糖正常参考值是：80～120mg／dl。当血糖超过120mg／dl时，称高血糖症；若血糖低于70mg／dl称为低糖症。血糖增高多见于糖尿病、甲亢、脑垂体前叶功能亢进、肾上腺皮质和髓质功能亢进等。而血糖过低多见于胰岛素分泌过多、肾上腺皮质功能减退、脑垂体前叶功能减退、甲状腺功能减退等。

二、葡萄糖氧化酶偶联法（GOD－POD法）

【实验目的】

1．掌握葡萄糖氧化酶偶联法测定血糖的原理和方法。

2．了解血糖测定的临床意义。

【实验原理】

GOD催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢，过氧化氢被偶联的POD催化释放出初生态的氧，后者将色原性氧受体4－氨基安替比林偶联酚的酚氧化，并与4－氨基安替比林结合生成红色醌类化合物。

【实验器材】

试管；水浴箱；分光光度计；血清。

【实验试剂】

1．0．1mol／L磷酸盐缓冲液（pH　7．0）　溶解无水磷酸氢二钠8．67g及无水磷酸二氢钾5．3g于800ml蒸馏水中，用1mol／L氢氧化钠或盐酸调pH至7．0，然后用蒸馏水稀释至1L。

2．酶试剂　取GOD　1　200U（国际单位），POD　1　200U（国际单位），4－氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg，加上述磷酸盐缓冲液至80ml左右，调pH至7．0，然后加磷酸盐缓冲液至100mL，置冰箱保存，至少可稳定3个月。

3．酚试剂　酚100mg溶于100ml蒸馏水中（酚在空气中易氧化成红色，可先配成500g／L的溶液，储存于棕色瓶中，用时稀释）。

4．酶酚混合试剂　酶试剂和酚试剂等量混合，冰箱中可保存1个月。

5．12mmol／L苯甲酸溶液　称取苯甲酸1．4g，加入蒸馏水900ml，加热助溶，冷却后加蒸馏水至1　000ml。

6．葡萄糖标准储存液（100mmol／L）　准确称取无水葡萄糖（预先置80℃烤箱中干燥至恒重，移置干燥器中保存）1．802g，用12mmol／L苯甲酸溶液溶解，移至100ml容量瓶中，再以12mmol／L苯甲酸溶液稀释至刻度，摇匀，移入棕色瓶中，冰箱内保存。

7．葡萄糖标准应用液（5mmol／L）　准确吸取葡萄糖标准储存液5．0ml，置于100ml容量瓶中，再以12mmol／L苯甲酸溶液稀释至刻度。

【实验方法】

1．加样步骤　取3只试管，做好标记，按附表13取液：

附表13　GOD－POD法测定血糖加样步骤

混匀，37℃水浴中保温15min，于分光光度计505nm波长处，空白管调零，分别读取标准管及测定管光吸收值。

2．血糖含量计算

【注意事项】

1．D－葡萄糖有α型和β型之分，两者在溶液中可互变，达到平衡时，α型约占36%，β型约占64%。新配制的葡萄糖标准液须放置2h以上（最好过夜），待变旋平衡后方可应用。GOD对β－D－葡萄糖有高度特异性，所以在GOD试剂盒中多数含有葡萄糖变旋酶，可加速这反应，但在终点法中，延长孵育时间可达到完成自发变旋。

2．GOD－POD法的初始反应（第一步反应）特异性高，而指示反应（第二步反应）的特异性较差，干扰往往发生在指示反应。溶血标本、黄疸标本及高脂血标本均不影响测定结果，但血液中的一些还原物质，如维生素C、谷胱甘肽及左旋多巴可与色原性氧受体竞争H2O2，使结果出现偏差。

3．GOD－POD法测定血糖的线性范围至少可达20mmol／L；回收率94%～105%。

（李　红）