血清丙氨酸氨基转移酶活性的测定（赖氏法）

【实验目的】

1．掌握丙氨酸氨基转移酶的作用机制及临床意义。

2．熟悉丙氨酸氨基转移酶活性的测定方法。

【实验原理】

以丙氨酸及α－酮戊二酸为基质液，在血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）作用下，生成丙酮酸及谷氨酸，丙酮酸能与2，4－二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，可用分光光度计测定其光吸收A值，通过标准曲线计算出丙氨酸氨基转移酶的活性。反应体系中产生丙酮酸的多少，即反映出酶活性的大小。

反应如下：

【实验器材】

试管；分光光度计；微型加样器（移液器）；恒温水浴锅；血清。

【实验试剂】

1．0．1mol／L pH　7．4磷酸盐缓冲液　称取KH2PO42．18g，Na2HPO411．93g加水配成1　000ml，调pH　7．4。

2．丙氨酸氨基转移酶基质液　精确称取DL－丙氨酸1．78g，α－酮戊二酸29．2mg，放烧杯内，加上述磷酸盐缓冲液约30ml，然后以1mol／L NaOH溶液校正pH至7．4，将其全部移到100ml容量瓶中，再加磷酸盐缓冲液稀释至刻度，混匀，加氯仿数滴防腐，置冰箱中保存。

3．显色剂　取2，4－二硝基苯肼20mg，溶于17ml的浓盐酸中，加水至100ml，置棕色瓶中放冰箱内。

4．丙酮酸标准液（2mmol／L）　准确称取分析纯级的丙酮酸钠22mg，用0．1mol／L pH7．4磷酸盐缓冲液定容至100ml。

5．0．4mol／L的NaOH液　称取16g NaOH加水定容至1　000ml。

【实验方法】

（一）样品酶活性测定

1．取两支试管编号，按附表15操作：

附表15　ALT活性测定试剂用量表

2．室温放置　10min，以对照管调“零”点，用波长520nm比色，读取光吸收A值。

3．从标准曲线中查得ALT活性单位。

（二）酶活性标准曲线绘制

1．取5支试管编号，按附表16操作：

附表16　标准曲线绘制试剂用量表

（续　表）

2．室温放置10min，以对照管调零点，读取各管在520nm处的光吸收A值。

3．以A值为纵坐标，酶活性单位为横坐标，作图绘成标准曲线。

【注意事项】

1．应用新的不溶血的血清测定。溶血标本中转氨酶活力较高，会影响测定效果。

2．超过200单位者要用生理盐水将血清稀释10倍后重做。

3．操作中加0．4mol／L NaOH液时，需以较慢速度加入，并且边加边摇匀。否则α－酮戊二酸引起的发色增强。

4．实验中的各管条件要保持一致。

【临床意义】

丙氨酸氨基转移酶主要存在于肝细胞中，正常血清中含量很低。当肝脏细胞受损时，细胞膜通透性增强，释放于血清中，导致血清丙氨酸氨基转移酶活性增强。因此，该酶活性可作为肝细胞损伤程度及预后判定指标之一。

急性病毒性肝炎和中毒性肝细胞坏死时，ALT明显升高。慢性肝炎、肝硬化、肝癌及心肌梗死时ALT中度升高，阻塞性黄疸和胆道炎症时，ALT中度升高。

正常参考值：5～25卡门氏单位。

（秦子平）