对中国云南省天然湖泊中鱼类病原性病毒的监测

源利文、普孝英、谢杰、董义(音）、吴德意、孔海南、杨晓霞、高原辉彦、本庄三惠、山中裕树、川端善一郎

1 引言

淡水鱼中出现的传染性疾病不仅会打击水产养殖业，而且殃及整个生态系统，一旦暴发疫情，往往会造成巨大的损失。直到近来，传染病疫情的爆发一直很难预测，而最近分子生物学技术的进步，使我们能够更为容易地从水体中检测出病原体或是量化出数值（Honjo et al， 2010；Minamoo et al，2009b；Haramoto et al，2007）。本文中，我们在洱海和滇池这两个中国云南的高原湖泊中，对6种代表性的鱼类病原性病毒——3种DNA病毒和3种RNA病毒——进行了监测。

鲤科疱疹病毒1型、2型和3型（Cy-HV1、Cy-HV2和Cy-HV3）为本研究所监测的DNA病毒。这些病毒具有双链的DNA基因组，属于疱疹病毒，疱疹病毒下有4个属。所有的Cy HV都属于鲤鱼病毒属（国际病毒分类委员会：http：//www.ictvonline.org/）。CyHV会感染鲤科鱼类并引发严重的疾病。Cy-HV1被认为是导致鲤鱼痘疮病的诱因，主要感染普通鲤鱼（Cyprinus carpio carpio）及其观赏性亚种锦鲤（C.carpio koi）。Cy-HV2是导致造血组织坏死的原因。不论个头大小几乎所有的金鱼（Carassius auratus）都易受这种病毒的感染（Jung、Miyazaki， 1995）。Cy-HV3是锦鲤疱疹病毒病的病原体，主要感染普通鲤鱼和锦鲤。感染了这些病毒的鱼类死亡率较高，例如感染了Cy-HV3的鱼超过80%会死亡（Ronen et al，2003）.

本研究中监测的RNA病毒为3种弹状病毒——传染性造血组织坏死病毒（IHNV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）和鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）。弹状病毒内含单链负股RNA基因组，外层有脂蛋白包膜。弹状病毒被分为6个属。IHNV和VHSV属于粒外弹状病毒属，而SVCV则属于水泡病毒属。弹状病毒感染在全球范围均有发生，而且我们在此研究的这3种病毒会给诸多宿主生物带来多种损害，它们被世界动物卫生组织认定为高度易感病毒。IHNV的主要宿主为鲑科鱼类，然而人们发现包括胡瓜鱼目在内的鲑科以外的鱼类偶尔也会被感染（世界动物卫生组织，2012）。我们之所以将IHNV作为研究对象，是因为洱海引进了太湖新银鱼（Neosalanx taihuensis）这种胡瓜鱼目的鱼类，且目前这种鱼已经成为洱海的优势物种（Kang et al，2009）。VHSV能够感染80多种海水及淡水鱼类，而且有时鱼类的野生种群中也会暴发疫情（世界动物卫生组织， 2009b）。SVCV则会引发很多鲤鱼品种及其他某些鲤科和鲶鱼品种的急性出血性传染病毒血症（世界动物卫生组织，2009a）。感染了这些弹状病毒的鱼类死亡率高达100%（世界动物卫生组织， 2009b），因此这些病毒的入侵乃至存在都受到高度关注。

虽然尚无中国天然淡水水域爆发这些病毒性疾病的报告，但是考虑到这种爆发可能引发的经济损失和可能带来的对生态系统的破坏，很有必要对它们的存在/浓度含量进行监测。本文将报告我们在滇池和洱海这两个中国云南的天然湖泊中监测到的Cy HV和弹状病毒的情况。

2 研究地点

图1 研究地点：中国云南省的滇池（图中D处）和洱海（图中E处）（左图）。两个湖泊均设了6个采样点（D1—D6为滇池，中图；E1—E6为洱海，右图。）

滇池是云南省最大的湖泊，也是中国最大 的 高 原 湖 泊。滇 池 位 于 北 纬24.67°～25.02°，东经102.60°～102.78°（图1）。湖面海拔高度为1887m。最大水深和平均水深分别为8.0m和4.4m，湖面面积为298km2。滇池长39km（从北到南），最大宽度为12.5km。洱海则仅次于滇池，为中国的第二大高原湖泊。位于北纬25.60°～96°，东经100.10°～100.29°（图1）。湖面海拔高度为1974 m。最大水深和平均水深分别为20.9m和10.5m，湖面面积为250km2。洱海长42km（从北-西北到南-东南），最大宽度为8.4km。我们在两个湖泊各设了6个取样点（图1）。

3 研究方法

3.1 水样的采集

我们于2010年8月3日采集了滇池表层水的水样。洱海表层水的水样则于2010年8月5日、11月21日和2011年2月25日、5月14日进行了采集。2010年8月采集的水样与此前一篇论文（Xie etal，2013）中报告的水样为同一样本。我们在采集现场测定了水温、p H值和氧化还原电位（ORP）。2010年8月采集了4L的水样，而其余8L的水样则是于其他采样日采集而来的。这些水样被装入塑料罐内运送到实验室，并于采样后的24h内对病毒进行了浓缩。

3.2 病毒的浓缩

病毒的浓缩是在一家以前从未对我们的目标病毒做过处理的科研机构进行的，基本依据上文提及的浓缩方法进行操作，只是稍做了一些改动（Honjo et al， 2010；Minamoto et al，2009a）。简而言之，我们在水样中添加了已知数量的λ噬菌体（最终浓度：1×107个粒子/L）作为外标，来测评Cy HV的浓度。预过滤水样中的病毒被涂覆了Al3+离子的HA负电荷过滤器（孔径=0.45μm；HAWP14250；密理博公司，日本东京）捕获。用0.5m M的H2SO4漂洗后，再用100m L的1.0 m MNa OH对病毒进行洗脱。添加1m L的100×TE缓冲液（p H8.0）进行中和，再使用相对离心率5000×g的离心机（Amicon Ultra-15，30-k Da截留分子量，密理博公司）进一步浓缩病毒溶液。最终获得的病毒浓缩液体积为400μL。

3.3 病毒DNA的提取和Cy HV的量化

总DNA的提取，使用了DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒（DNcasy Blood&Tissue Kit，Qiagen公司，德国希尔登），按照使用说明从200μL的总病毒溶液中，最终提取出了100μL的病毒DNA溶液。总DNA在使用前，一直储存于-20℃的环境下。

为了防止实验室受到污染，PCR实验是在另一家研究机构进行的，未在进行病毒浓缩和DNA提取的研究机构进行。Cy HV和λ噬菌体DNA的量化，使用了带有Step One Plus实时PCR系统的荧光定量（Taqman）PCR（Life Technologies公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。用于检测Cy-HV1的引物和探针是由本研究项目开发的，而用于检测Cy-HV2的引物和探针则是Goodwin等（2006）开发的。量化Cy-HV3的方法是Gilad等（2004）开发的，由Honjo等（2010）进行了修改，且相同的PCR条件还被应用于量化其他Cy HV之中。各引物及探针的序列如表1所示。各Taq Man反应都于1×PCR Mastermix溶液（Taq Man Gene Expres-sion Mastermix；Life Technologies公司）中使用了900n M引物和125n MTaq-Man探针，以及2μl DNA溶液对40m L原始水样（2010年8月所取水样）或是2μl DNA溶液对80m L原始水样（其他水样）。每一份反应混合物的总体积均为20μl。提供的PCR条件为：50℃下2min、95℃下10min、95℃下40个15s的循环和60℃下40个60s的循环。每组反复进行3次。我们使用了一系列经过稀释的PCR产物来获取标准曲线，这些PCR产物来自于Cy-HV1或Cg-HV2复制成的质粒，或是Cy-HV3或λ噬菌体的全基因组DNA（3×101-3×104份复制）。所有的q PCR实验均采用了3孔的无模板阴性对照，但并未显现出扩增。我们用λ噬菌体与 Cy HV-3的相对回收率（1.4∶1），估算出了Cy HV的浓度（Hon-joetal，2010）。

为了确认各取样点引物组的特异性，各取样点提取的对q PCR呈阳性反应的q PCR扩增子均经Exo SAP-IT产物纯化试剂盒（USB公司，美国俄亥俄州克利夫兰）处理后，直接进行了测序。这些序列是委托商业测序服务（宝生物公司，日本东京）进行确定的。

3.4 病毒RNA的提取、逆转录和弹状病毒的检测

总RNA是从200μl总病毒溶液中提取出来的，按操作说明使用了ISOGEN-LSRNA提取试剂盒（Nippon Gene公司，日本东京）。用12.5μl不含RNA酶的水稀释总RNA，提取出RNA提取后，立即使用Prime Script II第一链c DNA合成试剂盒（宝生物公司，日本大津）进行了逆转录。逆转录中使用了随机六聚体作引物，并在42℃条件下进行了1h。将c DNA溶液的最终体积调整为100μl，保存于-20℃条件下直至使用。

表1 本研究所用引物和Taqman探针的序列

续表

注：序列中，“Y”表示C或T，“K”表示G或T，“R”表示A或G

我们在另一家研究机构，并非完成病毒浓缩和RNA提取及逆转录的研究机构，进行了PCR实验。实验采用了Liu等（2008）开发的方法，我们准备了含有3×101至3×104份复制的一系列经过稀释的标准物，作为复制到质粒中并被扩增为三份的PCR产物，以获取标准曲线。IHNV、VHSV和SYCV标准物的基因型，分别为基因型组U（genogroup U，水生病原体传染性造血组织坏死病毒的分子流行病学：http：//gis.nacse.org/ih-nv/）、基因型Ib（Pierce，Stepien2012）和基因亚型组Id（subgenogroup Id）（Zhang etal，2009）。如上文所述，我们采用了无模板阴性对照。由于没有可用于评估弹状病毒回收率的外标病毒，所以我们没有进行绝对量化。我们的测序确认如上所述。

3.5 使用环境DNA进行的鲤鱼密度评估

我们在上文所述手法（Takahara et al，2012）的基础上做了一些细微的改进，使用环境DNA（e DNA）对鲤鱼密度进行了估算。简而言之，将500m L湖水倒入孔径为0.8μm的过滤装置（ATIP04700：密理博公司）中，将过滤盘浸泡于10m L蒸馏水中并予以搅拌。然后使用离心超滤设备（Amicon Ultra-15，30-k Da截留分子量，UFC903096；密理博公司）在离心率5000×g下运转10～15min，浓缩悬浮液。所有试样的搅拌和浓缩步骤均反复进行3次。浓缩后的样本溶液体积为200～350μL，使用DNeasy血液组织DNA提取试剂盒提取出所有样本溶液中的e DNA。每一份e DNA样本的最终体积均为100μL。

我们使用实时荧光定量（Taqman） PCR进行了e DNA的量化。对线粒体细胞色素b基因片段进行的扩增和定量中，使用的引物为Cp Cy B_496F和Cp Cy B_573R，探针为Cp Cy B_550p（表1）。这些引物适用于普通鲤鱼，可以扩增一个78-bp片段。反应混合物的成分和热循环条件均与上文的说明相同。使用的标准物和阴性对照也与用于弹状病毒检测的相同。

4 结果

4.1 云南省湖泊中Cy HV的量化

λ噬菌体——用于确认病毒浓缩效率的外部标准物——在所有的DNA样本中都成功得以扩增，因此我们得出的结论是这些样本中没有发生PCR抑制作用。滇池和洱海水样的λ噬菌体平均回收率分别为7.7%和6.4%。2010年8月滇池中3种Cy HV的浓度和2010年8月至2011年5月洱海中3种Cy HV的浓度分别列入了表2。2010年8月的调查结果已经用中文投稿发表（Xieetal，2013）。在1份滇池水样和3份洱海水样中检测到了CyHV-1。CyHV-1的最大浓度为5.6× 103copies1-1。在2份滇池水样和3份洱海水样中检测到了Cy HV-2。Cy HV-2的最大浓度为l.3×105copies1-1。滇池水样中没有检测出Cy HV-3，而洱海的9份水样呈Cy HV-3阳性反应。所有采集于11月的洱海水样都呈Cy HV-3阳性反应，最大浓度为1.1×103copies1-1。每一份水样的Cy HV检测限值都列入了表2，我们发现平均检测限值为341 copies1-1.

我们对各采样点中q PCR阳性反应的q PCR扩增子进行了直接测序，其DDBJ检索号为AB709901-AB709905。Cy HV-1、Cy HV-2和Cy HV-3的测序结果与报告出的序列的匹配率分别为99%～100%、100%、100%。

4.2 云南省湖泊中弹状病毒的检测

我们对滇池和洱海中是否存在3种弹状病毒（表2）进行了检测。关于这三种弹状病毒，IHNV在任何水样中均未被检出。24份洱海水样中，有14份检出了VHSV，而滇池水样中未检出。由于没有可用于评估弹状病毒回收率的外标，我们假设所有水样的总回收率是一定的，根据实时PCR的结果，计算出了VHSV的相对浓度（图2）。VHSV的相对浓度在冬季更高。SVCV则分别在0个滇池水样和4个洱海水样中得以检出。

我们对各采样点中q PCR阳性反应的q PCR扩增子进行了直接测序，其DDBJ检索号为 AB709906和 AB709907。关于VHSV，得到的103-bp序列与基因型为Ib的株病毒（strain virus）（Pierce，Stepien 2012）相同。关于SVCV，得到的36-bp序列与基因亚型组Id（Zhang et al，2009）相同。

图2 洱海中VHSV的相对密度

注：将最大浓度（E1于2011年2月）设为1，画出了各自的相对值。E1—E6表示洱海的采样点（图1）

4.3 洱海中的鲤鱼密度

我们对2010年11月至2011年5月间采集到的洱海水样，使用e DNA定量法估算了鲤鱼的生物量。在生物量估算中，我们应用了一条回归线[y=0.020x+0.00012；y=估计的生物量（mg·1-1）， x=e DNAcopiesl-1]，该回归线是根据人工池塘实验的结果估算出来的（Taka-hara et al，未发表资料）。在2010年11月采集到的5份水样、2011年2月采集到的1份水样和2011年5月采集到的6份水样中，检出鲤鱼DNA的分别为5份、1份、1份。估算出的普通鲤鱼的生物量为1.9～13.2mg·L-1（表2）。

表2 水质及病毒检测/量化参数

续表

续表

注：a表示因设备故障未能确定。

b表示2010年8月调查中检测到的DNA病毒数据来源于Xie等（2013）。

5 讨论

本文中，我们尝试了对Cy HV-1， Cy HV-2，Cy HV-3和IHNV，VHSV， SVCV这6种病毒进行检测或量化，结果成功检出了除IHNV外的所有病毒。这6种病毒之中，只有存在于自然水体中的Cy HV3病毒的动态资料较为丰富，可供研究。而据我们所知，这是第一份在天然水样中检出SVCV的报告。

洱海的24份水样中有9份检出了Cy HV-3。曾有学者报告过中国的一个水产养殖池暴发Cy HY-3引发的锦鲤疱疹病，并从病鱼样本中分离出了病毒（Dong et al，2011；Liu et al，2002）。然而，目前尚无自然环境中暴发疫情的报告。我们检测到的Cy HV 3最大浓度为1073 copiesl-1，这个数值记录于11月份。虽然几乎没有疫情暴发期或是暴发后不久的Cy HY-3浓度数值，但是据报告该数值为5×104～8×104copiesl-1（参见表2；Minamoto et al，2012）。因此，目前的Cy HV3浓度表明，尚无立即暴发疫情的可能性，但是对病毒浓度进行持续性监测十分重要。

研究人员已经报告了日本淡水中Cy HV-3的动态，这些病毒可导致鱼类的大量死亡 （Minamoto et al，2009a， 2009b，2012）。日本几乎所有河流中都曾检出过Cy HV-3的DNA，但是病原体的存在并不一定引发疫情（Minamoto et al， 2012）。研究者们预测病原体之外的其他环境因素也决定着疫情是否暴发。因此对宿主物种——普通鲤鱼的密度也进行了检测。一般来说，传染性疾病的传播程度或速度与宿主物种的密度密切相关（Hudson et al，2001）。我们使用最近开发出来的一种e DNA方法对鲤鱼密度进行了估算，得出的数据表明，洱海中普通鲤鱼的密度处于检测限值以下至13.2 mg·l-1这一范围内，这个数据低于Ibarai湖泻湖的估算值（最大值282mg·l-1）， Ibarai湖在本次调查的7年前爆发过一次Cy HV-3引发的疫情（Takahara et al， 2012）。洱海鲤鱼的低密度可能有助于抑制疫情暴发。虽然尚无明确数据，但许多其他因素也可能有助于抑制Cy HV-3的暴发。我们期待长期的病毒监测和数据积累，能够推动对引发或抑制疫情暴发的环境因素进行的相关研究取得进展。

虽然尚无中国暴发Cy HY-1疫情的报告，但是滇池和洱海中都检测出了这种病毒。Cy HY-1主要感染普通鲤鱼和锦鲤，而这些湖泊中鲤鱼群的低密度可能有助于抑制疫情暴发，就像Cy HY-3那样。与此类似的是，两座湖泊中均检出了Cy HY-2，但是同样也没有中国在自然环境下暴发相关疫情的报告。Cy HV-2会感染金鱼和鲫鱼（Fichietal，2013），鲫鱼是金鱼的野生型亚种，分布广泛，是生活在包括云南在内的中国内陆地区人们的蛋白质来源之一（Chu、Zhou，1989）。而且一些鲤亚科鱼类是这种病毒的潜在载体，尽管Cy HV-2在不同物种体内的复制能力可能不同（Ito、Maeno，2014）。关于这两种病毒在自然环境下的动态，相关信息十分有限，因此需要对这些病毒及其他基础信息进行持续监测，这些基础信息包括病毒近亲种类的易感性和病毒感染的风险评估。

洱海和滇池中均未检出IHNV。与其他弹状病毒相比，据目前研究所见IH-NV的宿主范围相对较窄，主要感染鲑形目。中国东北地区曾暴发过IHNV，而且对活鱼进行检测时也曾发现过疑似感染的事例（Liu et al，2008），但是从未有过中国南方暴发这种病毒的报告。鉴于我们的调查结果和云南鲜有鲑形目鱼类的现状（Chu、Chen，1999），这种病毒或许不需要加以关注。

VHSV在超过一半的洱海水样中都得以检出，而滇池水样中并未检出。所有2011年2月采集于洱海的水样都呈VHSV阳性反应，而且病毒的相对浓度显示出了年度波动，其峰值出现在冬季。病毒性出血性败血症疫情通常会在1℃～15℃条件下暴发，我们采样时的平均水温为14.6℃，因此病毒相对浓度的冬季峰值是合理的。

虽然尚无中国爆发病毒性出血性败血症疫情的报告，但是洱海的多处检出了相关病毒的遗传物质。当然，检测到RNA片段和检测到病毒本身并不相同，但是现在已有报告指出鱼类样本中检测到的病毒和水样中检测到的遗传物质（病毒RNA）间存在密切关联（Bain et al， 2010）。因此，我们的研究结果表明， VHSV已经侵入了中国的天然湖泊。虽然已知较易感染VHSV的82种鱼类均不生息于洱海中，且基因型Ib株系病毒通常都是从海水鱼中分离出来的（Chu、Zhou， 1989；世界动物卫生组织，2009b），但是VHSV的宿主范围非常广泛，所以有可能存在一种尚未得到确定的易感物种。这种疾病一旦爆发，将会产生相当大的损失，因此有必要监测这种病原体的动态，并找出其在洱海中的宿主物种。

研究人员已从中国的鱼类中分离出了一个传染性SVCV微粒（Liu et al， 2004），并报告了一例在市场所购鱼类中检出此病毒的事例（Liu et al，2008）。这两例均未观察到临床症状，而且至今仍无爆发疫病的相关报告。因此，SVCV有可能在未被识别的情况下已在自然环境中扩散。在本研究中，4份采自洱海的水样中检出了SVCV。SVCV可感染的鲤科鱼类范围广泛，因此在多种鲤科鱼类生息的云南省（Kang et al，2009；Yuan et al， 2010；Zheng et al，2004）对这种病毒进行监测是非常重要的。

我们的研究揭示了云南的天然湖泊中存在某些鱼类病原病毒的现状，尽管尚无这些湖泊爆发疫情的报告。在中国将鲤科鱼类作为食物来源的需求量很高，尤其是在云南省这样的内陆地区。事实上，鲤鱼及其近亲鱼类全球产量的2/3来自中国（联合国粮食及农业组织，渔业统计数据/全球产量；http：//www.fao.org/fishery/statistics/global-production/en）。如果鲤科鱼类爆发了传染性疾病，可预见的经济和生态影响将会十分严重。因此，应当事先评估这类事件的风险并准备好应对措施。

非本地鱼类的水产养殖不断增加，导致20世纪80年代以来洱海鱼类种群的生物多样性出现了显著下降（Wu、Wang， 1999）。自那之后一直观测到生物多样性的丧失，但其发生机制仍不清楚，传染性疾病的因素无法排除。从21世纪初期起，为了保护鱼类多样性，已经逐渐禁止养殖外来鱼种，并对捕鱼做了严格限制。此外，还采取了很多改善水质的措施，湖畔地貌已经恢复到了接近自然的状态（Yang，2009）。事实上，近年来已有报告称洱海的水质自2004年以来已经得到显著提高（Yang，2009）。保护湖边温度环境的异质性或是生息地的异质性是控制传染性疾病的一个有效办法（Uchii et al， 2011；Yamanaka et al，2010），而且对这种环境多样性的维护可能有助于控制洱海爆发病毒引发的疫病，即便湖水中存在病毒。

本文中，我们明确了湖中存在病原病毒遗传物质的事实，尽管并未检测到与此相关的疾病。这表明，对病原体的监测在预测或者预防传染性疾病方面可能会成为一种强有力的工具。然而，这种监测方法无法评估病毒的传染性。因此，我们需要进一步研究，明确病毒复制数与感染风险间的关联。在不久的将来，随着这类研究的积累和下一代测序等综合技术的发展，将使传染性疾病的预测或预防成为现实。

致谢

衷心感谢日本综合地球环境学研究所（RIHN）C-06研究项目成员给予我们的帮助。本研究得到了RIHNC-06研究项目和日本文部科学省青年研究补助金（B：20710013）的支持。其中，源利文、本庄三惠、山中裕树、川端善一郎均为日本京都大学生态研究中心的科研人员。

参考文献

BAIN M B，CORNWELL E R，HOPE K M，et al.2010.Distribution of an invasive aquatic pathogen(Viral hemorrhagic septicemia vims） in the Great Lakes and its relationship to ship-ping[J].PLo SOne5(4）：e 10156.doi：10. 1371/journal.pone.0010156

CHUX，CHENY.1999.The fishes of Yunnan [M].Science Press，Bejing

CHU X，ZHOU W.1989.Fishes of Erhai[M]. In：Science and Technology Commission of Da-li DEA(ed）Collected scienific works on Erhai Lake in Yunnan.Science and Technology Commission of Dali，Dali Erhai Administra-tion，Dali：1-30.

DONG C，WENG S，LI W，et al.2011.Charac-terization of a new cell line from caudal fin of koi，Cyprinus carpio koi，and first isolation of Cyprinid herpesvirus 3 in China[J].Virus Res 161(2）：140-149.doi：10.1016/j.virusres. 2011.07.016

FICHI G，CARDETI G，COCUMELLI C，et al. 2013.Detection of Cyprinid herpesvirus 2 in association with an Aeromonas sobria infection of Carassius carassius[J].J Fish Dis36(10）：823-830.doi：10.11111/jfd.l2048

GILAD O，YUN S，ZAGMUTT.VERGARA F J，et al.2004.Concentrations of a Koi herpes-virus(KHV）in tissues of experimentally in-fected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time Taq Man PCR[J].Diseases Aquat Or-gan60(3）：179-187.

GOODWIN A E，MERRY G E，SADLER J. 2006.Detection of the herpesviral hematopoi-etic necrosis disease agent(Cyprinid herpesvir-us 2）in moribund and healthy goldfish：valida-tion of a quantitative PCR diagnostic method [J].Dis Aquat Organ69(2-3）：137-143.

HARAMOTO E，KITAJIMA M，KATAYA-MA H，et al.2007.Detection of koi herpes-virus DNA in river water in Japan[J].J Fish Dis30(I）：59-61.

HONJO M N，MINAMOTO T，MATSUI K，et al.2010.Quantification of cyprinid herpesvir-us-）in environmental water by using an exter-nal standard virus[J].Appl Environ Microbiol 76：161-168.

HUDSON P J，RIZZOLI A，GRENFELL B T， et al.2001.The ecology of wildlife diseases [M].Oxford University Press，Oxford.

ITO T，MAENO Y.2014.Susceptibility of Jap-anese Cyprininae fish species to cyprinid her-pesvirus 2(Cy HV-2）[J].Vet Microbiol169 (3-4）：128-134.doi：l0.1016/j.vctmic.2014. 01.002.

JUNG S J，MIYAZAKI T.1995.Herpesviral haematopoietic necrosis of goldfish，Carassius auratus[J].J Fish Dis18(3）：211-220.

KANG B，HE D，PERRETT L，et al.2009. Fish and fisheries in the Upper Mekong：cur-rent assessment of the fish community，threats and conservation[J].Rev Fish Biol Fisheries19 (4）：465-480.

LIU H，SHI X，GAO L，et al.2002.Study on theaetiology of koi epizootic disease using the method of nested-polymerase chain reaction as-say (nested-PCR）[J].Huazhong Agric Univ21(5）：414-419.

LIU H，GAO L，SHI X，et al.2004.Isolation of spring viraemia of carp virus(SVCV）from cultured koi(Cyprinus carpio koi）and com-mon carp(C.c01pio c01pio）in P.R.China [J].Bull Eur Assoc Fish Pathol 24(4）：194-202.

LIU Z，TENG Y，LIU H，et al.2008.Simulta-neous detection of three fish rhabdoviruses u-sing multiplex real-time quantitative RTPCR assay[J].JVirol Methods149(1）：103-109.

MINAMOTO T，HONJO M N，KAWABATA Z.2009a.Seasonal distribution of cyprinid herpesvirus 3 in Lake Biwa[J].Appl Environ Microbiol 75：6900-6904.

MINAMOTO T，HONJO M N，UCHII K，et al.2009b.Detection of cyprinid herpesvirus 3 DNA in river water during and after an out-break[J].Vet Microbiol135：261-266.

MINAMOTO T，HONJO M N，YAMANAKA H，et al.2012.Nationwide Cyprinid herpes-virus 3 contamination in natural rivers of Japan [J].Res Vet Sci93(1）：508-514.doi：IO. J016/j.rvsc.20I1.06.004.

PIERCE L R，STEPIEN C A.2012.Evolution and biogeography of an emerging quasispecies：diversity patterns of the fish Viral Hemorrhag-ic Septicemia virus(VHSv）[J].Mol Phylo-genet Evol63(2）：327-341.doi：I0.1016/j. ympcv.2011.I2.024.

RONEN A，PERELBERG A，ABRAMOWITZ J，et al.2003.Efficient vaccine against the vi-rus causing a lethal disease in cultured Cypri-nus carpio[J].Vaccine21：4677-4684.

TAKAHARA T，MINAMOTO T，YAMANA-KA H，et al.2012.Estimation of fish biomass using environmental DNA[J].PLo S ONE 7 (4）：e35868.

UCHII K，TELSCHOW A，MINAMOTO T，et al.2011.Transmission dynamics of an emer-ging infectious disease in wildlife through host reproductivecycles[J].ISMEJ5：244

World Organization for Animal Health.2009a. Spring viraemia of carp.In：Manual of diag-nostic tests for aquatic animals2009[R]. World Organization for Animal Health，Paris：262-278.

World Organization for Animal Health.2009b. Viral haemorrhagic septicaemia.In：Manual of diagnostic tests for aquatic animals 2009[R]. World Organization for Animal Health，Paris：279-298.

World Organization for Animal Health.2012. Infectious Haematopoietic Necrosis.In：Man-ual of diagnostic tests for aquatic animals 2012 [R].World Organization for Animal Health， Paris：300-313.

WU Q L，WANG Y F.1999.On the succession of aquatic communities in Lake Erhai[J].J Lake Sci11：267-273.

XIE J，WU D，CHEN X，et al.2013.Relation-ship between aquatic vegetation and water quality in the littoral zones of Lake Dian-chi and Lake Er-hai[J].Environ Sci Tech(Wu-han）36(2）：61-65(in Chinese）.

YAMANAK A H，KOHMATSU Y，MINAMO-TO T，et al.2010.Spatial variation and tem-poral stability of littoral water temperature rel-ative to lakeshore morphometry：environmen-tal analysis from the view of fish thermal ecol-ogy[J].Limnology11(1）：71-76.doi：10. 1007/s10201-009-0281-9.

YANG B.2009.Current status and counter-measures of protecting and fathering Erhai wetland[J].Sichuan For Explor Design1：57-60.

YUAN G，RU H，LIU X.2010.Fish diversity and fishery resources in lakes of Yunnan Plat-eau during 2007—2008[J].Lake Sci22(6）：837-841.

ZHANG N Z，ZHANG L F，JIANG Y N，et al. 2009.Molecular analysis of spring viraemia of carp virus in China：a fatal aquatic viral disease that might spread in East Asian[J].PLo S ONE4(7）：c6337.doi：10.1371/journal.ponc. 0006337.

ZHENG B R，ZHANG Y P，XIAO C J，et al. 2004.The genetic evidence for sympatric spe-ciation pattern of Cypri11us from Erhai Lake [J].Acta Genet Sinica31(9）：976-982.

[1] 原载于Limnology（2015）16：69-77，Springer. DOI10.1007/s10201-014-0440-5