苯酚—硫酸法测定多糖的含量

一、目的要求

1．掌握苯酚—硫酸法测定多糖含量的原理。

2．学习苯酚—硫酸法测定多糖浓度的方法。

二、实验原理

多糖在强酸（浓硫酸）的作用下，水解生成不同的单糖组分并迅速被强氧化剂浓硫酸脱水生成糖醛衍生物，该衍生物可以和苯酚缩合成橙黄色的化合物，并在波长490 nm和一定的浓度范围内，其颜色深浅与糖醛衍生物浓度正相关，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。

三、仪器与试剂

万能粉碎机如图2-1-1所示。

蛹虫草子实体粉末：蛹虫草子实体经75℃烘干后粉碎，再过100目筛，干燥保存备用。

葡萄糖标准溶液：精密称取干燥的葡萄糖0.50 g，稀释定容后置于100 m L容量瓶中，充分摇匀，取出1 m L溶液于50 m L容量瓶中定容，制得100 µg/m L葡萄糖标准溶液，备用。

5%苯酚溶液：在60℃水浴中溶解苯酚晶体5 g，加入100 g蒸馏水，混合均匀，放置在棕色瓶中于4℃冰箱中保存备用。

仪器：高速万能粉碎机、电子天平、电热恒温水浴锅、紫外—可见分光光度计。

图2-1-1 万能粉碎机

四、实验操作与步骤

1．葡萄糖标准曲线的绘制

分别取备用的100 µg/m L葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 m L至试管中，各加蒸馏水至 2 m L，使每支试管中的葡萄糖浓度为 0、10、20、30、40、50、60、70 µg/m L。再分别加入5%的苯酚溶液1 m L、浓硫酸5 m L，充分震荡摇匀，静置5 min后，放入沸水浴中加热15 min，取出后在流动的自来水中迅速冷却。以2 m L蒸馏水代替葡萄糖溶液按同样的显色操作得到的空白试剂为参比，在 490 nm 波长下测量各组的吸光值。每样需平行3次，取平均值。以吸光度值对应浓度做标准曲线。

2．未知样品的多糖含量测定

精确称取干燥的10.0 g蛹虫草子实体粉末至烧杯中，按1∶30的料液比，加入300 m L蒸馏水，搅拌均匀之后在80℃的恒温水浴中热回流提取1 h，提取两次，将每一次的提取液过滤后混合，减压浓缩至原体积的1/3，加入3倍量的无水乙醇沉淀，静置6 h，抽滤，对沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，干燥称重，命名为虫草粗多糖I。

准确称取50.0 mg虫草粗多糖I使用蒸馏水定容到50 m L容量瓶中，按照葡萄糖标准曲线绘制的方法进行样品的测定，平行测定 3 次，取平均值，根据换算系数为 0.9，代入葡萄糖标准曲线，计算出样品相应的多糖含量。

五、实验说明

（1）苯酚使用前需要新鲜配制。

（2）测定多糖含量要注意换算系数。

（3）控制好显色反应的温度和时间。

六、思考题

1．测定多糖的含量方法有哪些？

2．分析苯酚—硫酸法测定多糖的主要影响因素。