双水相系统中蛋白质分配系数的测定

一、目的要求

了解蛋白质在双水相系统中分配系数的测定方法。

二、实验原理

在双水相系统中，生物大分子物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中，当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下两相中的浓度比，称为分配系数K，可用下式表示：

K=C1/C2

本实验以糖化酶为实验对象，在PEG/硫酸铵双水相系统中进行分配，用考马斯亮蓝比色法测定两相中总蛋白含量，求分配系数。

三、仪器与试剂

电子天平、10 m L离心管、台式离心机、移液管、小滴管、50 m L容量瓶和试管及试管架、722分光光度计、记号笔等。

糖化酶、PEG400、硫酸铵、结晶牛血清白蛋白、考马斯亮蓝 G-250、85%磷酸、95%乙醇等。

四、实验操作与步骤

1．实验操作

在10 m L离心管中，用电子天平称取硫酸铵固体1.30 g，PEG400液体2.00 g，用吸管加入已稀释的糖化酶液2.00 m L，然后加水，直到总量为8.00 g，用橡胶塞塞紧，用力振荡数分钟，使硫酸铵完全溶解，并使两相充分混合，以便酶在两相中分配达到平衡，然后，在台式离心机离心3 min，转速3 000 r/min，分别读出上下两相的体积，求相比，并用考马斯亮蓝比色法测定两相中蛋白浓度，求分配系数。

2．考马斯亮蓝测定蛋白质含量

（1）考马斯亮蓝G-250染色液：取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 m L95%乙醇中，加100 m L 85%磷酸，加水稀释至1 L。

（2）标准蛋白溶液：用牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成120 μg/m L的蛋白质标准溶液。

标准原液的配制：在分析天平上精确称取 0.060 g 结晶牛血清白蛋白，于小烧杯内，加入0.526 g Na Cl，溶于少量蒸馏水中，后转入500 m L容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成标准原液，其中牛血清白蛋白浓度为120 μg/m L。

（3）标准曲线的绘制：分别取8支试管，编号，按表2-7-1加入试剂，混匀，室温放置5～30 min。用722分光光度计在595 nm处比色。记录1～6管所读吸光值，以蛋白质含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

表2-7-1 数据记录表

（4）样品液的蛋白含量测定。

上相液：吸取上相溶液0.5 m L，用水稀释定容到50 m L，吸取1 m L定容液于试管中，按照上表加入试剂，混匀，室温放置5～30 min，测定吸光度。

下相液：吸取下相溶液0.1 m L，加蒸馏水0.9 m L于试管中，按照上表加入试剂，混匀，室温放置5～30 min，测定吸光度。

根据样品吸光值在标准曲线上查出对应蛋白质含量，再由不同的稀释倍数，计算出上下两相中蛋白质的质量浓度（mg/m L），然后根据K=C1/C2，计算出分配系数。

五、实验说明

（1）测定蛋白含量所用参比溶液分别为上下相未加蛋白样品的溶液。

（2）由于考马斯亮蓝染色能力强，比色杯一定要洗干净。

（3）比色皿可以选用玻璃比色皿。

六、思考题

1．双水相萃取分配系数的大小与哪些因素有关？

2．哪些因素影响吸光度的测定？