用高分辨质谱法确定化合物的结构

一、 实验目的

（1） 学习质谱分析的基本原理。

（2） 了解质谱仪的基本构造、 工作原理及操作方法。

（3） 学习质谱图解析的基本方法。

二、 实验原理

质谱分析法主要是通过对样品的离子的质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 因此， 质谱仪都必须有电离装置把样品电离为离子， 由质量分析装置把不同质荷比的离子分开， 经检测器检测之后可以得到样品的质谱图， 由于有机样品、 无机样品和同位素样品等具有不同的形态、 性质和不同的分析要求， 所以， 它们所用的电离装置、 质量分析装置和检测装置有所不同。 但是， 不管是哪种类型的质谱仪， 其基本组成是相同的， 都包括离子源、 质量分析器、 检测器和真空系统。

离子源的作用是将欲分析样品电离， 得到带有样品信息的离子。 质谱仪的离子源种类很多， 有电子电离源、 化学电离源、 快原子轰击源、 电喷雾源、 大气压化学电离源等。

电喷雾源（ESI）是近年来出现的一种新的离子源。 它主要应用于液相色谱-质谱联用仪。 它既作为液相色谱和质谱仪之间的接口装置， 同时又是电离装置。 它的主要部件是一个由多层套管组成的电喷雾喷嘴。 最内层是液相色谱流出物， 外层是喷射气， 喷射气常采用大流量的氮气， 其作用是使喷出的液体容易分散成微滴。 另外， 在喷嘴的斜前方还有一个补助气喷嘴， 补助气的作用是使微滴的溶剂快速蒸发。 在微滴蒸发过程中表面电荷密度逐渐增大，当增大到某个临界值时，离子就可以从表面蒸发出来。离子产生后，借助喷嘴与锥孔之间的电压，穿过取样孔进入分析器。加到喷嘴上的电压可以是正，也可以是负。 通过调节极性， 可以得到正或负离子的质谱。其中值得一提的是电喷雾喷嘴的角度，如果喷嘴正对取样孔， 则取样孔易堵塞。因此，有的电喷雾喷嘴设计成喷射方向与取样孔不在一条线上，而错开一定角度。这样溶剂雾滴不会直接喷到取样孔上，使取样孔比较干净，不易堵塞。产生的离子靠电场的作用引入取样孔，进入分析器。电喷雾源采用一种软电离方式，即便是分子量大、 稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解， 它适合分析极性强的大分子有机化合物， 如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。 这样， 一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷，则其质荷比只有1000Da，进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点，目前采用电喷雾电离，可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。

大气压化学电离源（APCI）的结构与电喷雾源大致相同， 不同之处是大气压化学电离源喷嘴的下游放置一个针状放电电极， 通过放电电极的高压放电， 使空气中某些中性分子电离，产生H3O＋、N2＋、O2＋和O＋等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应， 使分析物分子离子化， 这些反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子、 质子脱离和电子捕获产生负离子等。 大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物。 有些分析物由于结构和极性方面的原因， 用ESI不能产生足够强的离子， 可以采用APCI方式增加离子产率， 可以认为APCI是ESI的补充。 APCI主要产生的是单电荷离子，所以其分析的化合物分子量一般小于1000Da。 用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子，主要是准分子离子。

质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m／z顺序分开并排列成谱。 用于有机质谱仪的质量分析器有磁式双聚焦分析器、 四极杆分析器、 离子阱分析器、 飞行时间分析器、 回旋共振分析器等。

质谱仪的检测主要使用电子倍增器， 也有的使用光电倍增管。 由四极杆出来的离子打到高能极产生电子， 电子经电子倍增器产生电信号， 记录不同离子的信号即得质谱。 信号增益与倍增器电压有关， 提高倍增器电压可以提高灵敏度， 但同时会降低倍增器的寿命， 因此，应该在保证仪器灵敏度的情况下采用尽量低的倍增器电压。 由倍增器出来的电信号被送入计算机储存， 这些信号经计算机处理后可以得到色谱图、 质谱图及其他各种信息。

为了保证离子源中灯丝的正常工作， 保证离子在离子源和分析器中正常运行， 消减不必要的离子碰撞、 散射效应、 复合反应和离子-分子反应， 减小本底与记忆效应， 质谱仪的离子源和质量分析器都必须处在优于10-5mbar的真空中才能工作。也就是说，质谱仪都必须有真空系统。 一般真空系统由机械真空泵和扩散泵或涡轮分子泵组成。 机械真空泵能达到的极限真空度为10-3mbar，不能满足要求， 必须依靠高真空泵。 扩散泵是常用的高真空泵，其性能稳定可靠， 其缺点是启动慢， 从停机状态到仪器能正常工作所需时间长； 涡轮分子泵则相反， 仪器启动快， 但使用寿命不如扩散泵。 但由于涡轮分子泵使用方便， 没有油的扩散污染问题， 因此， 近年来生产的质谱仪大多使用涡轮分子泵。 涡轮分子泵直接与离子源或质量分析器相连， 抽出的气体再由机械真空泵排到体系之外。

质谱仪的分辨率是指把相邻两个质量分开的能力， 常用R表示， 即在质量M处刚刚分开M和M＋ΔM两个质量的离子， 则质谱仪的分辨率见式（6-1）：

两峰刚刚分开是指两峰的峰谷是峰高的10％（两峰各提供5％）。 一般情况下， R≤5000为低分辨质谱，R＝2×104～3×104为中级质谱，R＞3×104为高级质谱。低分辨质谱仪只能给出整数的离子质量数； 高分辨质谱仪则可给出小数的离子质量数。 低分辨质谱的质核比由标称质量计算， 高分辨质谱由精确质量计算。 标称质量由在自然界中最大丰度同位素的标称原子质量计算而得。精确质量是以12C同位素的质量12.0000为基准而确定的。

高分辨质谱可以区分具有相同标称质量的不同物质， 见表6-1。

表6－1 标称质量相同但精确质量不同的物质

高分辨质谱中物质的分子离子或碎片离子的确认是通过查高分辨质谱的Beynon表或通过计算推导得出的。 经验已知高分辨质谱的误差在±0.006范围内。

本实验对已知结构的苯仿卡因样品进行验证性测定， 其分子式为：C9H11NO2，相对分子质量为165.0790，结构如图6-1所示。

图6－1 苯仿卡因的结构

本实验采用高分辨质谱仪测定苯仿卡因的质谱。

三、 实验仪器及试剂

1. 仪器

（1） 高分辨质谱仪；

（2） 超声波仪；

（3） 针头式过滤器。

2. 试剂

（1） 甲醇（色谱纯）；

（2） 苯仿卡因。

四、 实验步骤

（1） 检查高分辨质谱仪及其配套设施， 确认其处于正常状态。

（2） 依次打开显示器、 计算机主机、 打印机、 高分辨质谱仪电源开关， 确认仪器处于正常状态。

（3） 双击“Masslynx”图标进入“Masslynx”主菜单， 设置参数， 使仪器处于最佳工作状态。

（4） 测定样品。 在内置蠕动泵上的注射器装入被测样品， 进样。

（5） 点击“Acquire”， 输入“Data File Name”“Function”“Start Mass”“End Mass”等参数，然后点击“Start”开始正式采集质谱图。

（6） 在质谱图窗口中， 可以对谱图进行“Smooth”（平滑）、“Subtract”（扣底）、“Center”（棒图）等处理， 点击主菜单栏“File”选择“Print”， 即可打印报告。

（7） 取出注射器， 倒出样品并清洗干净。

（8） 测试完成后， 按操作要求， 进行仪器关机。

（9） 解析质谱图， 确定化合物的结构。

思 考 题

1. 何为分子离子？ 它在质谱解析中有何用处？

2. 一台完好的质谱仪应包含哪几部分？ 它们各起什么作用？