蛋白质沉淀和变性思考题

1.两性性质和等电点

蛋白质多肽链上N端有氨基、C端有羧基，其侧链上也常含游离的碱性基团和酸性基团等。因此，和氨基酸相似，蛋白质也具有两性性质和等电点。蛋白质溶液在不同的p H溶液中以不同的形式存在，其平衡体系如下（Pr表示蛋白质分子）：

调节溶液p H，使蛋白质分子主要以两性离子存在，此时溶液的p H称为该蛋白质的等电点（p I），不同的蛋白质具有不同的等电点，见表13-4。

表13-4 几种蛋白质的等电点

在等电点时，蛋白质的溶解度最小，导电性、黏度、渗透压等也都最低。利用蛋白质的这些性质，可以分离提纯蛋白质；也可以通过调节蛋白质溶液的p H，使其颗粒带上某种净电荷，利用电泳分离或提纯蛋白质。

思考题13-5 乳酪蛋白的等电点为4．6，问在p H＝3和p H＝5的溶液中以什么离子形式存在？在电场中向阳极还是向阴极移动？

2.胶体性质

蛋白质是高分子化合物，其分子颗粒直径在1～100nm之间，属于胶体，因而具有胶体溶液的特性，如布朗运动、光散射现象、电泳现象、不能透过半透膜等。

蛋白质能够形成稳定的亲水胶，一是因为蛋白质分子表面带有各种极性基团，能与水形成氢键而发生水化作用，在蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，使粒子碰撞时不易聚集发生沉淀；另一原因是蛋白质在非等电状态时，其粒子都带有同性电荷，颗粒之间相互排斥，不易产生凝聚和沉淀。

利用胶体对半透膜的不可渗透性，可将蛋白质溶液中小分子物质与蛋白质分离，得到较为纯净的蛋白质。这种以半透膜分离和提纯蛋白质的方法称为透析法。

3.蛋白质的沉淀

蛋白质在水溶液中的稳定性是相对的，如果改变各种相对稳定的条件，除去水化膜和电荷，蛋白质分子就会发生凝聚而产生沉淀。按蛋白质沉淀的性质不同，分为可逆沉淀和不可逆沉淀两种。

（1）可逆沉淀 可逆沉淀指沉淀出来的蛋白质分子构象基本上没有发生改变，仍然保持原有的生物活性，只要除去沉淀因素，则蛋白质仍能保持原有的溶解状态。

盐析是常用于分离提纯蛋白质的方法，属于可逆沉淀。即在蛋白质溶液中加入足量的中性盐，夺取蛋白质分子外围的水化膜，同时，电解质离子能削弱蛋白质所带电荷，使蛋白质分子相互聚集，从而沉淀出来。不同蛋白质盐析所需盐的最低浓度不同，因此，在含有不同蛋白质的溶液中，可以通过调节盐浓度，分离纯化蛋白质。

（2）不可逆沉淀 不可逆沉淀指沉淀出来的蛋白质分子构象已发生改变，并失去了原有的活性，即使除去沉淀因素，沉淀的蛋白质也不会重新溶解。许多物理或化学因素都能引起蛋白质的不可逆沉淀。常用的方法有：

1）有机溶剂沉淀法 在蛋白质溶液中加入适量的水溶性有机溶剂，如乙醇、丙酮等，由于这些溶剂的水合力大于蛋白质，能夺取蛋白质分子外围的水化膜，使蛋白质粒子脱去水化膜而沉淀。这种作用在短时间和低温时，沉淀是可逆的，但若时间较长或温度较高时，则为不可逆。

2）重金属盐沉淀法 重金属离子如Hg2＋、Ag＋、Pb2＋及Fe3＋等，能与蛋白质阴离子结合，形成不溶性盐而沉淀。例如：

3）生物碱试剂沉淀法 苦味酸、磷钨酸、三氯乙酸等都能与蛋白质阳离子结合成不溶性盐而沉淀。例如：

当发生重金属盐中毒时，可口服大量生牛奶和生鸡蛋，利用的就是这一原理。

此外，强酸、强碱、紫外线、加热和X射线照射等物理因素，都可以使蛋白质发生不可逆沉淀。

4.蛋白质的变性

由于物理和化学因素的影响，导致蛋白质空间结构改变了，它的理化和生物活性也随之发生改变，这种现象称为蛋白质的变性。蛋白质变性时，其一级结构不变，而是氢键等副键遭到破坏，使原来有序的、紧密的特定构象变为无序的、松散的伸展结构。

蛋白质变性分为可逆变性和不可逆变性，在大多情况下，变性是不可逆的。如果蛋白质在变性初期，分子构象未遭到深度破坏（只破坏了三级结构，二级结构未变），那么还有可能恢复原来的结构和性质，则这种变性是可逆的。需注意的是蛋白质沉淀与变性之间的区别。沉淀不一定变性，如蛋白质的盐析；反之，变性也不一定沉淀，如蛋白质受强碱或强酸作用后，常因其颗粒带同性电荷，能保持在溶液中而无沉淀现象。然而，蛋白质的不可逆沉淀一定是变性蛋白质。

蛋白质的变性作用在生活实践中有重要的意义。如对于酶制剂与蛋白类激素，要尽力防止变性，以免丧失生物活性；而使高温、高压或酒精等消毒方法都是为了使细菌蛋白质变性。

思考题13-6 蛋白质的变性与蛋白质的沉淀有何区别？

思考题13-7 若重金属盐中毒，为什么可用牛乳或鸡蛋清解毒？

思考题13-8 不同等电点的蛋白质混合时常常发生沉淀，例如胰岛素（p I＝5．3）和鱼精蛋白质（p I＝10），两者混合于纯水中即有沉淀生成，为什么？

思考题13-9 用化学方法鉴别下列化合物：

（1）蛋白质水溶液 （2）α-氨基酸 （3）淀粉