检测细菌具有鞭毛的培养方式

一、细菌涂片制备与染色结果观察

1.细菌涂片的制备

在无菌操作条件下，取洁净载玻片，用接种针挑取少许细菌新鲜培养物，均匀涂布于载玻片上的1滴无菌水中，自然干燥，经火焰固定，备用。

2.革兰染色

革兰染色是最基本的染色法，染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类。

染色方法：

（1）取少许细菌制作菌涂片。

（2）草酸铵结晶紫混合液染1分钟，自来水冲洗，去掉浮色。

（3）碘液媒染1分钟，自来水冲洗，吸干。

（4）95%乙醇或丙酮乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液无色（约30秒）。

（5）蕃红液染2～3分钟，自来水冲洗，自然风干。

结果观察：革兰阳性菌呈深紫色，革兰阴性菌呈红色。

注意事项：

（1）细菌培养基和培养条件对染色结果有一定影响，一般为24小时的培养物。

（2）细菌的涂片厚薄影响脱色效果，如果涂片太厚革兰阴性菌则可染成革兰阳性菌。乙醇的脱色时间太长，革兰阳性菌又会染成革兰阴性菌。

（3）染色结果可疑时，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，大肠埃希氏菌为阴性对照菌。

3.鞭毛染色

用于观察菌体体上有无鞭毛，鞭毛在菌体上的位置及鞭毛数量。在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定很重要。

染色方法：

（1）选择经乙醇处理过的载玻片。

（2）取少许细菌制做菌涂片，将细菌点在无菌水滴的顶部，不能搅动，以免鞭毛脱落。玻片置室温自然干燥。

（3）滴加染液于玻片，染色10～15分钟，用蒸馏水冲去染液，自然干燥。

结果观察：油镜检查时从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。

图10 细菌鞭毛数和排列

注意事项：

（1）鞭毛染色用载玻片选择光滑无痕纹的新载玻片，将玻片置片架，95%乙醇中浸泡24小时，取出后以火焰去乙醇，立即使用。

（2）染色菌落可以直接从平板（或斜面）上挑选。但必须注意动作尽量轻，以免鞭毛从菌体脱落。

（3）选取菌落应是生长在营养较好的琼脂平板上16～24小时培养物。培养基不可采用有抑制剂的选择性培养基。

（4）染色后蒸馏水冲洗时，应避免染液表面的金属光泽液膜滞留在玻片上，影响镜检。

（5）观察鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，多观察几个视野，以鞭毛数量最多的菌细胞为准。

4.荚膜染色

荚膜染色用于观察菌体有无荚膜结构。可选择墨水或5%黑色素水溶液。

染色方法：取少许细菌与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻压，吸去多余的菌液。置显微镜观察。

结果观察：在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，再转换高倍镜确认。背景为灰色，菌体较暗，在其菌体周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。

注意事项：

（1）荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。

（2）载玻片必须洁净无油迹，以免涂片量混合液不能均匀散开。

二、常见细菌病原体的形态特征

1. 屈桡杆菌（Mycococcus pisciola）

革兰阴性，两端钝圆，稍弯，成半圆形、圆形、U型、V型或Y型等，无鞭毛。菌体细长，粗细一致约0.5微米，菌体长2～24微米。以滑行或摇晃方式运动。生长温度28℃，最适温度 25℃，37℃仍能生长。18℃生长较漫，毒力明显变化，33℃生长快，毒力减弱， 40℃生长很慢，毒力很弱。培养基中含盐0.6%以上不生长。p H值6.5～8.0均可生长，p H值6.0以下和8.5以上不能生长。在胰胨琼脂平板上生长良好，菌落黄色，扩散性，中央较厚，显色较深，向四周扩散成颜色浅的假根头。分离培养基必须用贫营养基。

2.鳗弧菌（Vibrio anguillarum）

革兰阴性短杆菌，两端圆形，无荚膜，不形成芽孢，有运动力，极端单鞭毛，菌体大小为（0.5～0.7）×（1～2）微米。在普通琼脂培养基上形成圆形、边缘平滑、灰白色菌落。对弧菌抑制剂（O/129）敏感。TCBS培养基上形成黄色菌落。生长最适温度20～25℃，37℃不生长。生长p H值6～10，最适p H值为8。生长盐度0.5%～6.0%，最适盐度1.0%。

3.副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）

革兰阴性杆菌，端生单鞭毛，运动活泼，无芽孢，无荚膜。无盐培养基中不生长，最适氯化钠浓度为35克/升。含氯化钠琼脂平板菌落边缘不整齐，光滑湿润，不透明。对弧菌抑制剂（O/129）敏感。TCBS琼脂培养基菌落绿色。液体培养基表面形成菌膜。生长p H值7.0～9.5，最适p H值7.7。

4.溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）

革兰阴性，略呈弧状，常呈杆状、球状等多形态，没有荚膜，不形成芽孢，极端单鞭毛，有运动力。菌体大小（0.6～0.9）×（1.2～1.5）微米。无盐培养基中不生长，在 3%氯化钠平板上呈淡乳白色菌落，有的弥漫性生长。对弧菌抑制剂（O/129）敏感。在TCBS平板上呈黄色菌落。

5.哈维弧菌（Vibrio harveyi）

革兰阴性，短杆状，发光的海洋细菌，菌体直或稍弯曲，两端钝圆，无荚膜，不形成芽孢，极端单鞭毛能运动，单个存在，很少出现两个或链状排列，大小为（0.5～0.9）×（1.1～1.9）微米。无盐培养基中不生长，含盐营养琼脂平板上生长良好，28℃培养24小时菌落圆形光滑，边缘整齐，稍隆起，闪光。TCBS培养基平板上呈黄色菌落。4℃以下和40℃以上不能生长。

6.创伤弧菌(Vibrio vulnificus）

革兰阴性，极端单生鞭毛，嗜盐菌，有毒菌株一般具有荚膜，无芽孢，有运动力，无异染颗粒，菌体大小（0.5～0.8）×（1.4～2.6）微米。TCBS 培养基平板上呈凸面、平滑乳脂状的蓝绿色菌落。

7.嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）

革兰阴性，短杆状，极生单鞭毛，无荚膜，无芽孢。菌体大小（0.8～1.2）×（0.5～0.8）微米。琼脂平板上菌落呈圆形，培养24小时直径0.9～1.5毫米，48小时直径2.0～3.0毫米，灰白色，半透明，表面光滑湿润，边缘整齐，不产色素。RS培养基呈黄色圆形菌落。生长温度 4～40℃，最适温度 32℃，43℃不生长。4%氯化钠以下生长，6%不生长。p H值5.5～10.0生长。

8.温和气单胞菌（Aeromonas sobria）

革兰阴性短杆菌，端生鞭毛，菌体大小（0.3～1.0）×（1.0～3.5）微米。最适生长温度28℃。营养琼脂培养基上菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，中央有突起，白色或黄色，半透明。

9.豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)

革兰阴性短杆菌，有运动性，极端单鞭毛，无芽孢。菌体大小（1.0～1.6）×(0.5～0.8)微米。在营养琼脂、TSA培养基上形成圆形光滑的乳白色菌落。兔血平板上可呈现典型β溶血。对弧菌抑制剂（O/129）不敏感。TCBS培养基不生长。可在不含盐的培养基中生长。生长适宜盐度0%～100%，最适盐度15%～25%。生长温度5～40℃，最适温度22～25℃。生长p H值5.5～10.0，最适p H值7.8～8.5。

10.迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)

革兰阴性短杆菌，单个或成对排列，周生鞭毛，无芽孢，菌体大小为1.0×（2.0～3.0）微米。在普通营养琼脂平板上37℃培养24小时，形成圆形、隆起、灰白色、湿润并带有光泽、呈半透明状的菌落。血琼脂平板上在菌落周围能形成狭窄的p型溶血环。生长温度15～42℃，最适温度31℃。生长p H值5.5～9.0。

11.鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）

革兰阴性短杆状，周生鞭毛，25℃时能运动，37℃时不能运动。固体培养基培养6小时菌体大小0.50×1.75微米。在培养基上生长缓慢。血琼脂平板上，30℃培养48小时后，形成直径2.0毫米的菌落。最适生长温度25～30℃。

12.荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）

革兰阴性，菌体短杆状，两端圆形，大小为（0.7～0.75）×（0.4～0.45）微米，单个或两个相连。有运动力，极端着生1～3根鞭毛。无芽孢。琼脂培养基上菌落呈圆形，直径1.0～1.5毫米，表面光滑，边缘整齐，灰白色，半透明，培养20小时左右产生绿色或黄绿色素，弥漫培养基。肉汤培养生长均匀浑混浊，微有絮状沉淀。适宜生长温度 25～35℃， 55℃在30分钟死亡。最适盐分1.5%～2.5%。生长p H值5.5～8.5。

13.恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）

革兰阴性短杆菌，单个或成对相连，两端圆形，极生单或多鞭毛，有运动力，无芽孢，菌体大小（0.6～1.0)×（1.5～3.0）微米。普通营养琼脂平板生长，边缘整齐、圆形、扁平、白色透明的潮湿菌落，培养48小时后直径增大至3～4毫米，呈黄白色。TCBS培养基上生长缓慢，呈绿色透明菌落。

14.水型点状假单胞菌(Pseudomonas punctata f. ascitae)

革兰阴性短杆状，近圆形，单个排列，有动力，无芽孢。琼脂培养基上菌落呈圆形，24小时后略黄而稍灰白。

15.柱状屈桡杆菌（Flexibacteriasis columnaris）

革兰阴性，呈弯曲的长杆或丝状，菌体大小 0.5×(2.0～30.0)微米，无鞭毛，在固体物上能滑行运动。在含 0.5%氯化钠的噬纤维培养基、蛋白胨酵母等培养基中生长良好，菌落黏附于琼脂，呈黄色、扁平、表面粗糙、中间卷曲，边缘呈树技状。液体培养基，静止培养时表面形成黄色有韧性的膜，震荡培养时浑浊生长。生长温度5～35℃，最适温度20～25℃。生长p H值6.8～8.3，最适p H值7.5。生长含盐浓度0%～0.5%，1.0%时不生长。

16.海豚链球菌（Streptococcous iniae）

革兰阳性，二链或链状球菌，菌体卵圆形，有荚膜，无运动力，β溶血阳性，菌体大小0.7×1.4微米。普通营养琼脂平板上生长极为缓慢，48小时后仅形成直径约0.3毫米的极小菌群。血琼脂平板30℃培养24小时，形成直径约0.7毫米的白色菌落，边缘整齐，表面湿润，呈圆形。生长温度10～45℃，最适温度20～37℃。生长含盐浓度0%～7%，最适浓度0%。生长p H值3.5～10，最适p H值7.6。

17.海分支杆菌(Mycobacterium marinum）

革兰阳性，菌体为平直或微弯的杆菌，大小为有分支，呈丝状，不运动，好气性，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。菌体大小（0.2～0.6）×（1.0～10）微米，随培养条件有一定变化。对培养要求较高，生长缓慢，一般培养基不生长。在有光培养条件下菌落呈黄色或橘黄色。最适生长温度 30～32℃，37℃以上生长缓慢或不生长。染色时不易着色，需加温或延长染色时间，着色后能抵抗酸性乙醇的脱色，是抗酸细菌的代表。

三、血涂片的制作、染色及显微镜观察

1.血涂片的制作

采血方法 养殖鱼类的血液采集有心脏取血，断尾取血，尾动脉(静脉)取血等多种方法。

血涂片制作 取1片洁净载玻片，将流出的第二滴血滴在玻片右端。用另1张边缘光滑的洁净玻片，从末端边缘置于血滴左缘，稍向后退，血液就充满在两玻片的斜角中，再以30～40度（斜度愈小，涂片愈薄）角向左方推动，即涂成血液薄膜。自然干燥，备用。

推动时用力不能太大，推动要均匀并保持一定的速度。过慢，涂片则较厚。注意不能在同一张片子上涂第二次。

图11 血涂片制作

染色 血液染色采用涂片自然干燥后，在染色区域用特种铅笔画一方框，在菌膜上加数滴瑞氏染液，将血膜完全淹没，以防蒸发。1～2分钟后，滴加重蒸水或缓冲液，静置2～4分钟。用滴管吸去重蒸水，将多余染液慢慢冲去。即可观察。

封片 血涂片经染色、干燥后，可用中性树胶或浓香柏油封藏保存。在染色区域滴1滴中性树胶，取洁净盖玻片，从边缘置于载玻片，轻轻盖下盖玻片。注意不能产生气泡。

2.血涂片观察

（1）基本观察方法

肉眼观察 用肉眼对血涂片颜色进行观察，注意识别异常标本。如果养殖动物正常时末梢血液呈粉红色，患病动物血液颜色会有变化。

高倍镜观察 注意观察血涂片的制备和染色是否良好，细胞分布是否均匀，同时可估计白细胞数量的增减情况。最后从血涂片的交界区域进行观察，选择细胞分布均匀不重叠，标本不太厚，血细胞仅一层的区域进行油镜观察。

油镜观察 边移动视野边观察：胞质中的嗜染颗粒颜色3种（嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞）。以及淋巴细胞和血小板等血细胞形成。

（2）血细胞形态观察

鱼类的血细胞包括红细胞和白细胞，白细胞又有淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血栓细胞组成（彩图27）。

红细胞 为有核的椭圆形细胞。胞质呈粉红色或橘黄色，细胞核为紫色。细胞大小与鱼类的品种有关，细胞数量存在种间差异、季节差异、性别差异，以及不同生理状态下的差异。处于幼稚阶段的鱼类红细胞数量较多。细胞的大小与数量受环境变化影响。

观察时注意有无畸形红细胞、球形红细胞、椭圆形红细胞、靶形红细胞、口形红细胞（唇形红细胞）、中心淡染色红细胞、棘形红细胞、胆状红细胞、皱缩红细胞、泪滴状红细胞、破碎红细胞及镰状红细胞等。

白细胞 细胞核为蓝紫色，中性粒细胞的嗜染颗粒为淡蓝色，嗜酸性粒细胞的嗜染颗粒为红色，嗜碱性粒细胞的嗜染颗粒为蓝色。嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞随鱼类而异，少数鱼类有嗜碱性粒细胞，多数鱼类有嗜酸性粒细胞。血栓细胞具细胞核，有椭圆形、梭形、杆状等多种形态。细胞数量存在雌雄差异，有明显的季节波动，不同的鱼类也有相当大的变化，即使同一种鱼类，由于测定者不同，所得的值也会出现差异，同时还受到环境因子的影响。

3.注意事项

（1）新鲜涂片应立即染色。

（2）染色涂片水冲洗后，应在空气中自然干燥或风干，不可用火烤干。

（3）染液量要充足，勿使染液蒸发干燥。

（4）细胞染色过浅或过深，待标本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色数秒或数分钟。

（5）保存过久的细胞涂片，细胞染色会褪色，可重新染色。