水生动物疾病的诊断技术及产品应用

一、常用诊断试剂一般原理和分类

诊断试剂盒是指针对特定病原体开发的病原体检测和诊断试剂产品，通常指技术已经成熟的诊断试剂商品化产品。按其工作原理可分为两大类，一类是免疫学诊断试剂，通过针对病原体表面特征性抗原或毒力因子制备的特异性抗体，通过抗体与抗原的反应特异性检测病原。另一类是分子生物学诊断试剂，通过对病原体特定基因的扩增反应或探针结合检测病原。商品化诊断试剂盒要经过大量的反复试验和验证。

常用的病原体检测方法分类：

1.免疫学诊断试剂

免疫学诊断的基本原理是抗病原抗体对病原体表面特征性抗原或毒力因子的特异性结合，通过制备的专门抗体，通过抗体与抗原的反应特异性鉴别病原，再采用某种标记物使反应结果变得肉眼可见。免疫学诊断试剂根据抗体物及操作方法的不同可分为以下类型：

（1）凝集试验诊断试剂

通过颗粒性物质标记抗体或抗体直接与颗粒性抗原的反应检测抗原的方法。根据是直接与颗粒性抗原反应还是采用颗粒性物质标记抗原或抗体，又可分为直接凝集试验和间接凝集试验。

（2）直接凝集试验

采用抗体与颗粒性抗原发生凝集反应检测抗原的反应。直接凝集试验可用于检测细菌、真菌和寄生虫等颗粒性抗原，如常用的菌体凝集反应试剂等。采用直接凝集反应的诊断主要优点为快速简便，缺点是灵敏度较低。

（3）间接凝集试验

用颗粒性物质与抗体结合标记抗体，常用的颗粒性物质有红血球、碳粒、乳胶颗粒及金黄葡萄球菌等。间接凝集试验可用于测定小颗粒抗原和可溶性抗原，其灵敏度较直接凝集法大大提高；缺点是颗粒性物质的处理和抗体标记过程技术性较为复杂，处理不当易产生非特异性反应。临床上使用较多的是间接血凝试剂和乳胶颗粒诊断试剂。

2.酶联免疫吸附试验

通过标记酶特异性底物的显色来测定病原体。本方法的优点是快速灵敏，酶标记抗体可在低温下稳定保存数年以上。目前酶免疫吸附试验是临床应用最多的免疫测定方法，可用于多种疾病的快速测定。

（1）直接ELISA

用酶直接标记抗原或抗病原抗体，优点为反应可一步完成，缺点是灵敏性相对较差，且抗体标记技术要求较高。

（2）间接ELISA

用酶标记抗抗体，优点为反应灵敏性相高，标记抗体为针对特定动物的抗抗体，目前常用的兔抗体和鼠抗体均已有稳定的商品化酶标记抗体，只要获得抗病原的特异性抗体即可用于病原检测；间接ELISA的缺点是检测过程较长，且检测条件掌握不当可引起非特异性反应。

（3）夹心ELISA

先用抗病原体抗体吸附固相表面（固相抗体），通过固相抗体捕捉病原，再加入酶标记的抗病原抗体，进行ELISA测定。夹心ELISA灵敏度高、特异性好，适合于测定病原浓度较低的样品，且可有效降低测定的非特异性。

3.免疫荧光技术

用荧光素标记抗病原体特异抗体，用于检测样品中病原体的方法。本法可直接观察组织切片、血液或粘液涂片及脱落细胞等，直接检测病原，也可用于病原感染组织分布及抗原细胞内定位。荧光法较为灵敏、特异性也好，但需要较为昂贵的荧光显微镜。

（1）直接荧光染色法

用荧光素直接标记抗病原抗体，反应可一步完成，但检测灵敏度较差。

（2）间接荧光染色法

用荧光素标记抗抗体（第二抗体），反应需两步完成，但检测灵敏度也相应提高。

4.免疫酶技术

用酶标记抗病原抗体或第二抗体，通过底物显色及常规显微镜来观察和定位抗原。本法可直接观察组织切片、血液或粘液涂片及脱落细胞等，直接检测病原，也可用于病原感染组织分布及抗原细胞内定位，且不需要较为昂贵的荧光显微镜。但该技术有时因组织内源酶及非特异吸附等原因产生非特异性反应，特异性不如免疫荧光法。

5.点酶法（Dot-ELISA）

将抗原点样于膜表面，通过酶标记抗体对抗原的结合，通过酶的底物显色检测病原。

二、分子生物学诊断试剂

分子生物学诊断的基本原理是通过特定基因的扩增反应使目的基因大量扩增，再通过相关的核酸探针或其他手段检测扩增片段，或通过基因探针的标记使结果肉眼可见。利用抗原抗体反应检测病原体的方法主要有：

1.核酸探针技术

在液相或固相两个不同来源的核酸链按碱基互补配对原则形成异质双链的过程称为核酸分子杂交。核酸探针技术即是按照分子杂交基本原理，针对病原体的特定基因序列设计与特定基因序列互补的序列检测待检测病原的核酸序列。为使检测结果可见，通常对核酸探针进行标记，早期标记核酸探针多采用放射性同位素，近年来已经普遍采用地高辛标记的核酸探针，再通过抗地高辛检测，可与酶联技术相结合进行方便的检测。此外还可采用荧光素标记核酸探针应用于病原检测。常用的核酸探针技术及应用范围有以下几类：

（1）膜杂交试验

将待测样品点样于杂交膜，用核酸探针与之杂交。本方法需要提取待测病原的核酸用于杂交实验。

（2）原位杂交试验

用核酸探针对含有病原的病理组织切片进行杂交检测，可用于抗原的组织和细胞内定位。

2.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)

针对病原存在的特定基因序列，设计特异性引物，在DNA聚合酶作用下大量扩增出所需的目的基因片段,通过扩增的大量特定片段来测定病原。

包括三个基本步骤：双链 DNA 模板加热变性成单链(变性)；在低温下引物与单链 DNA互补配对(退火)；在适宜温度下Tap DNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸。PCR仪是用于PCR反应的专用仪器，目前已经有各种型号的PCR仪用于PCR反应。近年来，PCR仪已经发展到可几台联机操作、智能化以及中文面板等，极大降低了对基层实验室技术人员的要求。按照PCR检测对象、操作过程等不同，可分为以下不同的PCR方法。

（1）常规PCR

即经典PCR，通过特异性引物扩增病原体特定基因或核酸片段检测检测病原的方法，是目前病原检测中应用最广泛的方法。

（2）反转录PCR（RT－PCR）

主要针对RNA病毒，由于PCR反应是从DNA到DNA的扩增，对于RNA病毒，先需要将RNA的特定序列扩增出互补的DNA片段（c DNA），再对c DNA片段进行常规PCR扩增。RT-PCR是用于RNA病毒的分子检测方法。

（3）套式PCR（Nestd PCR）

在常规PCR扩增产物的基础上，再根据产物特定的基因序列，设计互补引物进行第二次PCR操作。通过两次PCR扩增，可大大提高目的基因的检测灵敏度，减少非特异性反应，提高检测特异性。

（4）实时荧光定量PCR（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，简称Real Time PCR）

实时荧光定量PCR技术是在传统PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时监测整个PCR进程及产物含量，以此确定样品中DNA拷贝数。实时荧光定量PCR可精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，且克服了终点PCR法进入平台期或饱和期后的定量误差，实现扩增核酸核酸片段的精确定量。对于RNA的检测，需要将RNA通过逆转录为c DNA，再对c DNA进行实时荧光定量PCR测定，该方法相应称为RT实时荧光定量PCR法。

与传统PCR方法相比，本法通过荧光的实时测定而达到定量的目的，具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。特别是近年来，随着荧光定量PCR仪产品价格的下降，该技术已成为临床检验及病原诊断中最为重要的标准化分子诊断技术。

（5）环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)

环介导等温扩增反应通过4种不同的特异性引物识别待测病原特异性基因的6个特定区域，并进行对目的基因的扩增反应。与传统PCR的区别在于：整个反应不需要反复进行高温解链、降温扩增这样的循环过程，全部反应可在等温条件下完成；基因扩增和产物检测可一步完成，扩增效率高，可在l5～6O分钟扩增1O9～l O10倍；反应特异性高。

所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别，目前许多试剂盒采用荧光染料SYBR Green与双链DNA的染色进行，并根据反应产生焦磷酸镁沉淀判断结果，只需用肉眼观察结果。

环介导等温扩增反应(LAMP) 除了高特异性、高灵敏度外，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果检测不需进行凝胶电泳和分析，可直接肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成判断LAMP反应结果，简便快捷，适合基层快速诊断。LAMP检测法的出现，改变了传统PCR检测技术对较昂贵的PCR仪和对PCR后产物复杂分析过程的依赖，使得许多病原的现场检测成为可能。

目前已经有许多采用LAMP的病原检测产品问世。在新版OIE水生动物病原检测手册中，已将LAMP方法进行重要病毒检测的推荐方法病毒方法。可以预见，在未来的诊断领域，LAMP方法及相关试剂盒将有可能成为诊断市场的主流技术和产品。WHO预测，到2015年，在疾病的临床诊断上，LAMP方法将取代目前所用的PCR方法。

LAMP 方法缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重，因此我们强烈推荐在进行试剂盒的研发过程中采用实时浑浊仪，不要把反应后的PCR管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合LAMP方法。

三、生物芯片技术

生物芯片又称DNA芯片或基因芯片，其技术基础是核酸的分子杂交。生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸分析检测技术。“芯片”概念源自电子芯片，即将已知的不同核酸序列采用类似电子芯片的方式排列在硅片、尼龙膜等材料上组成核酸微阵列（micro-arrays）或序列点阵,通过检测样品中的特定基因或转录产物分析样品中是否存在某一特定性序列，从而判定是否存在特定的疾病。通过将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度获取样品中对应核酸序列的分子数量和序列信息。

早期的生物芯片主要用于遗传性疾病相关基因的检测，通过对应于突变热点区的寡核苷酸探针合成或点加于DNA芯片上，通过一次杂交可完成对待测样品多种突变可能性的筛查，实现对多种遗传病的高效快速诊断，因此早期又称为基因芯片诊断。在病毒病诊断中，可通过将各种病毒特异性序列制成探针，有序地点阵到芯片上再与处理后的样本进行杂交，一次可检测出多种病毒，并可能鉴定出病毒亚型。目前这一技术已应用于细菌病、寄生虫病和病毒病的诊断以及细菌的耐药性测定中。

生物芯片有其它检测法难以比拟的优越性，但因问世与使用时间较短，目前仍有一定的局限性，主要表现在：技术成本高、对实验条件要求严、不利于普及推广。近年来，生物芯片技术已扩展通过免疫反应、受体结合等非核酸领域，出现了蛋白质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等，生物芯片这一词语也逐渐代替了原来的基因芯片这一概念。

目前对于水生动物疾病，还没有相关的生物芯片诊断盒。但对于这一技术，应用有所了解，并定期关注其诊断产品的动态进展。

四、诊断试剂的操作、质量控制及保存

1.诊断试剂的操作和质量控制

（1）诊断试剂的操作

目前成熟的诊断试剂盒，产品供应商提供了详细的试剂保存要求、检测操作说明、需要自己准备的试剂以及操作注意事项等，只要严格按照操作说明进行每一步操作即可。通常试剂商提供了阳性对照和阴性对照，每次操作都应该同时进行阳性和阴性对照，以保证检测结果因操作因素造成结果误判，保证检测过程和结果的质量控制。

由于病原存在地区性差异，建议县级以上的水生动物病害检测实验室，对当地列入疫病名录并有检疫要求的病原，应保存阳性和阴性的菌株（毒株）或标本（最好是当地分离株）。对每一种新使用的诊断试剂盒，诊断实验室应该用这些标准品对其进行验证试验，以确定诊断试剂的可靠性，从而保证样品检疫结果的可靠性。

（2）如何正确阅读试剂盒操作说明

采用诊断说明书进行诊断操作时，一定要事先认真仔细地阅读并掌握说明书提供的操作说明，是保证操作过程和结果正确的基本保证。切忌未搞懂即匆忙操作。

诊断试剂是具有较强专业性的产品，说明书的撰写较为简练，正确阅读理解需要相关的专业基础。阅读说明书的重点要搞懂以下关键：a.诊断试剂的针对性诊断病原；b.诊断方法原理；c. 试剂盒中各组份及保藏方法和注意事项；d.每步反应的使用浓度；e.试剂盒没有提供需要自己准备的试剂及正确配方；f.样品取样部位、取样和保藏方法。

（3）应该具备的诊断条件

根据实验室的条件来选择诊断试剂盒，如采用PCR试剂盒，一定要确认实验室PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪等是否处于正常的运转状态，工作人员对仪器操作是否合格。必要时请有关公司上门辅导运行；采用酶联免疫测定时，事先确认酶标仪、洗板机等运转状态，并对移液器进行校验。

2.诊断试剂的保存方法

用于诊断的免疫血清、抗体、酶、引物及诊断试剂盒等，属于不稳定的生物制品，在购买、运输及保存过程中，需要注意以下几个方面的问题。

（1）所有的试剂都由免疫血清或核酸探针、酶等组成，性状极不稳定。需要低温保存，要严格按照说明书要求的方式保存，未特别指明的，一般以4℃保存为好。购买时应低温携带，可采用保温盒或泡沫盒加冰携带，以免运输温度过高而失活或降低保存时间。

（2）诊断试剂使用后，要立即放回到 4℃保存，对于一些需要冰冻保存的酶，使用时应将试剂放在冰盒中，用完后立即放回冰箱冰冻保存。

（3）每次诊断都应当设阳性对照和阴性对照，只有阳性对照呈阳性、阴性对照呈阴性时有关测定结果才可靠。一般一种方法在实验室建立前，需要预先进行实验，以确定方法的可靠性和稳定性。

（4）测定的样品，一定要留样，以便实验结果出现疑问时再次测定。

五、如何根据养殖对象的病症选择诊断试剂

采用诊断试剂正确诊断疾病，关键在于如何正确使用的诊断试剂。每种诊断试剂都针对特定的病原设计的，对其他病原可能无法正确诊断。

1.选择诊断试剂应掌握的基本原则

选择正确的诊断试剂关键在于对不同养殖对象主要疾病的发病症状有正确的了解，同时正确了解每一种诊断试剂所针对疾病的病原、发病动物以及相应的临床病症。当技术员对相关知识和信息掌握不够时，应掌握以下几个原则：

（1）发病水生动物种类与诊断试剂针对的种类相同。每一种诊断试剂都会在说明书针对的疾病及发病动物，不要简单地根据病名相似就乱用诊断试剂，一定要保证针对相同的水生动物。

（2）发病水生动物的症状与诊断说明书的符合操作说明相同。通常诊断试剂说明书会简要介绍试剂所针对疾病的主要症状，如果说明书上缺失这一部分，技术人员可通过试剂所针对的病原，再通过水生动物疫病书籍或网络查询该病原引起疾病的主要症状，根据实际发病动物症状来确定应选用的诊断试剂。如同样是对虾疾病，由白斑病毒引起的症状与传染性皮下和造血器官引起的症状完全不同，操作人员通过网络查询，可基本区别两者不同点，确定需采用何种诊断试剂。

（3）注意不同发病季节最易发生的疾病种类，有助于选择正确的诊断试剂。

（4）正确分辨常见症状与病原的关系。寄生虫病可显微镜诊断基本确定，需要重点了解病毒病与细菌病临床症状的不同点。对于发病鱼类，两者有时会出现相似的症状，但通过仔细的分辨，还是可以确定两者的区别。

2.细菌和病毒的主要区别

病毒性鱼病：通常鳃盖、眼眶以及肌肉，不出现鳃丝腐烂症状；肠道出血，但肠壁完整，不出现糜烂；肛门通常无红肿，腹水少而透明，镜检无细菌。

细菌性鱼病：通常出现局部充血、脓肿、腐烂，体表可出现鳍条基部充血、蛀鳍、竖鳞，鳃丝有腐烂等；肠道出血同时伴肠壁糜烂变薄，严重肠炎还可出现肠空泡状；肛门红肿，腹水多而混浊，镜检可见大量细菌。

对于虾类疾病，症状较为相似，一般红体症状较为普遍，不象鱼类有明确的区别性症状，可通过对肌肉的镜检作出辅助性判断，以红体病为例，可根据对尾部及腹部肌肉镜检，如出现大量细菌，一般为细菌引起，如肌肉无明显细菌，可初步判断由病毒引起。这种方法必须采用濒死或刚死的虾或，已经腐烂的虾因已经发生细菌腐败或后续感染，不适用于镜检判断。

六、诊断试剂盒的使用说明--相关疾病诊断示例

（一）胶体金试剂检测罗氏沼虾野田村病毒

1.检测原理

罗氏沼虾肌肉白浊病病原是近年来新出现的疾病，又称白体病、白尾病等，其病原是罗氏沼虾野田村病毒（Macrobraichium rosenbergi Nodavirus, Mr NV）。试剂通过兔抗Mr NV多抗和金标记鼠抗Mr NV 单抗对病毒的结合，样本含有Mr NV时，病毒可与胶体金标记单抗形成Mr NV-金标抗体复合物，在检测区（T）显紫红色条带，剩余抗体可与羊抗鼠Ig G抗体结合，在控制区（C）形成紫红色条带，试纸出现两条紫红色条带为阳性。

2.诊断操作

（1）取待测虾苗1～2尾于EP管中，加入PBS溶液300微升，充分研磨，摇匀，离心取上清；

（2）吸取上清液，加3滴至金标试纸S孔中，同时另取金标试纸2张，分别加入3滴用PBS稀释3倍病毒阳性对照液和PBS；

（3）室温静置5～10分钟，等待紫红色条带的出现。10分钟后判定无效。

（4）结果判定：阳性（+）：出现两条紫红色条带。一条位于检测区（T）内，另一条位于控制区（C）内。阴性（-）：仅在控制区（C）内出现一条紫红色条带。在检测区（T）内无紫红色条带出现。无效：10分钟内在控制区（C）内无紫红色条带出现。提示操作不当或测试纸已失效。

图12 胶体金诊断试剂盒结果判定

3.注意事项

（1）本试纸条为一次性使用；打开铝箔袋后，请勿将测试纸置于空气中过久，以免受潮。

（2）如试纸条存放于冰箱，取出后需放置于室温10～30分钟。

（3）本胶体金试纸条可于4～30℃干燥保存，切忌冷冻，有效期达24个月。

（二）PCR试剂检测白斑综合征病毒（厦门鷺隆产品）

1.用途

试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR）技术对生物样品中的WSSV进行快速检测，具有高灵敏、高特异性等优点，适用于对虾苗种的筛选以及对虾养殖过程的跟踪监测。

2.检测步骤

（1）待测样品的选取：约需10毫克（约1/3米粒大小）对虾或其它虾池生物组织。仔虾或幼虾可整只用于检测，成虾可用镊子取其心脏、真皮、鳃、肠或消化腺等组织。阴性对照可取10微升重蒸水或10毫克无病毒感染的虾组织，与样品同时进行以下核酸提取，以便评估实验操作过程中是否存在交叉污染。

（2）将取得的虾组织置于0.5毫升规格小管内，滴入10滴裂解液，用牙签捣碎（约1～2分钟）。

（3）以12000转/分钟，离心3分钟，将上清液用微量移液器转移至新管内，然后加入吸附液（用前充分摇匀！）20微升，混匀。室温放置10分钟，其间摇匀3次。

（4）以10000转/分钟，离心30秒，弃上清，再离心5秒，用微量移液器吸干残余液体，滴入10滴洗涤液于沉淀中，用微量移液器轻轻吹动使沉淀充分悬浮起来。

（5）以10000转/分钟，离心30秒，弃上清，再离心5秒，用微量移液器吸干残余液体，将离心管置于PCR仪上60℃加热3分钟（打开离心管盖）。

（6）加蒸馏水20微升，充分悬浮沉淀。10000转/分钟，离心30秒，上清作为待测样本。

（7）取含PCR混合液的反应管，加入WSSV稳定液13微升，分别加2微升待测样本，以及阴性对照和阳性对照，用混合器混匀，10000转/分钟，离心3秒，即可作PCR反应。

PCR反应参数设置为：95℃变性2分钟，循环扩增94℃ 30秒，68℃ 60秒，共40个循环；最后68℃延伸2分钟。

（8）PCR反应完毕，取下层红色液体10微升作电泳检测，时间20～30分钟。紫外灯下观察，阳性对照泳道应有一条300 bp的清晰亮带；阴性对照在此平行位置应无带；对于样品如在此平行位置有一条带，则表明该样品含有病毒，若在此平行位置无带则该样品不含病毒。

3.注意事项

（1）试剂盒中含有液体的离心管使用前先在离心机上离心几秒钟，将液体离心到管底。

（2) 塑料滴瓶在使用前先摇匀，旋下盖子，轻轻挤压瓶子，正确滴下所需的滴数。

（3) 微量吸头、牙签等耗材应一次性使用，以防止交叉污染。

（4) 电泳缓冲液用前请稀释50倍。琼脂糖粉加入25毫升稀释的电泳缓冲液，置于三角烧瓶中，煮沸2～3次，琼脂糖粉溶解变清即可用制胶板制凝胶，也可以用微波炉加热溶解制胶。琼脂糖粉因含核酸染色剂溴化乙啶，有毒！制胶时带手套操作，避免接触皮肤。

（5) 试剂盒组成中序号1－7放置在2～8℃保藏，序号8－10于-20℃保藏，有效期为一年。

（三）传染性皮下和造血器官坏死病毒（LAMP法）（黄海水产研究所诊断产品）

1.自备器材

（1）保温设备：水浴锅或金属浴或可关闭热盖功能的PCR仪，也可用保温杯、温度计及薄泡沫板制成的简易保温装置。

（2）剪刀、镊子等取样工具；灭菌牙签及一次性手套。

2.操作步骤

（1）取待测对虾样品0.1克，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状。根据虾的大小，可取整虾或对虾鳃丝或附肢（成虾）；

（2）用牙签蘸取浆状样品，分别将自封袋里对应编号小管中的采样用膜片充分湿润； （3）用吸管吸取A液2-3滴，加在小管内湿润的采样用膜片上，另取新牙签轻轻搅动膜片30秒；

（4）用牙签将上述采样用膜片转移到相同编号的漂洗管内，剧烈震荡漂洗管3～4分钟；

（5）用新牙签将上述漂洗馆内的膜片和自封袋中的阳性对照膜片、阴性对照膜片转移到相应编号的核酸变性管内，95℃保温4分钟，再迅速置于冷水中或室温条件下2分钟；

（6）用新牙签将上述核酸变性管内膜片转移到相同编号的IHHNV检测管内，将检测管置于57～60℃保温50分钟。保温可根据实验条件采用水浴锅、金属浴、PCR仪；使用PCR仪时务必关闭热盖功能程序；

（7）90～95℃条件下保温4分钟，迅速将IHHNV检测管上下反复甩动30秒，使反应液与管盖上核酸染料充分混匀；

（8）用力向下甩动IHHNV检测管，使管内已混合核酸染料的反应液集聚与扩增检测管底部，1～2分钟后肉眼观察反应液颜色。

3.检测结果判别

（1）阳性对照显示为绿色，阴性对照显示为橙黄色，否则应判定实验结果无效；

（2）样品检测结果为绿色表示样品 IHHNV 检测结果为阳性，显示橙黄色则表示样品IHHNV检测结果为阴性。

4.说明

（1）反应管的绿色强弱代表了对虾皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的多少，绿色越强说明样品携带病毒量越多；

（2）将检测管置于光线充足和黑色背景条件下，有助于结果观察；试剂盒顶盖内侧为黑色背景，有助于检测结果观察判别；

（3）试剂盒顶盖内侧贴有用来比对图片，请参照使用；图片中加号“++++”、“+++”、“++”、“+”表示阳性的强弱，加号越多表示病毒含量越多。

5.注意事项

（1）请务必将试剂盒保存于4℃至-20℃的条件下，否则会严重缩短试剂盒的保质期；

（2）试剂盒开封使用时，请先检查HPV检测管，HPV检测管内液体应为无色透明，如果某编号检测管内液体呈现浅红色或橙黄色，说明该编号HPV检测管已不可用；

（3) 对虾组织研磨时，勿以对虾肝胰脏、肠道为材料，否则采样用膜片无法漂洗干净，影响检测结果的准确性；

（4) 检测过程中，每一步骤中用牙签转移阳性对照膜片、阴性对照膜片、不同样品及采样用膜片必须更换新牙签，以防发生交叉污染；

（5) 检测完成后，切勿打开扩增检测管盖子，以防止核酸产物污染环境，导致该环境以后检测出现假阳性。

习题：

1.简述细菌的结构？

2.细菌的分类和命名法？

3.简述细菌性烂鳃病的病原体、病症和流行情况？

4.赤皮病的病症是什么？

5.竖鳞病的流行情况？

6.细菌性肠炎病病症和流行情况？

7.水霉病的病原体？

8.细菌性败血症的病原、病症和流行情况？

9.打印病的病症和流行情况？

10.斑点叉尾鮰肠型败血症的病症和流行情况？

11.弧菌病的病症和流行情况？

12.对虾甲壳溃疡病的病原和病症？

13.对虾幼体弧菌病流行情况？

14.对虾幼体肠道细菌病的病原和流行情况？

15.常用诊断试剂的分类？

16.分子生物学诊断试剂在水生动物疾病病原检测中的应用有哪些方法？

17.诊断试剂应用应该具备的条件？

18.诊断试剂的保存方法？

19.如何根据养殖对象的病症选择诊断试剂？

20.细菌与病毒有主要区别？