一、组织病理检测固定液与固定方法
组织固定的目的是通过物理和化学方法使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止细胞自溶，以保持细胞原有形态和组织结构，减少细胞可溶性蛋白、脂肪、糖类等物质的损失和丢失。
常用固定剂分为醛类、醇类和重金属类。组织样品常用的固定剂有 5%～10%福尔马林（36%甲醛溶液）和4%多聚甲醛。
电子显微镜观察用固定剂一般用2.5%戊二醛 + 2%多聚甲醛混合液固定后，再用1%锇酸（0.1%磷酸盐缓冲液配制）固定，经脱水后树脂包埋。
二、注意事项
1.固定剂的固定作用随温度升高而加强，一般温度为-70～37℃，以室温为常用。某些酶的固定要求在37℃以下，病毒需要在低温下处理，常用温度4℃。
2.10%中性甲醛，4%多聚甲醛和05%乙醇最为常用，在37℃或室温固定，适合于许多蛋白质抗原。
3.固定时间根据组织块大小、固定液的种类及浓度、固定所用温度等而定。一般固定12～24小时。冰冻切片的固定，一般用4℃冷丙酮在室温下固定10分钟。
三、常用组织病理学检测标本制备
1.涂片
涂片是最常用的制片技术之一，通常用于检查水生动物体表、腮部粘液及肠道，血液涂片的制备也是常用的技术。对于体表、肠道和腮部粘液，通常在洁净载玻片上先加一滴蒸馏水，用眼科镊子在待检查部位轻轻刮取少量粘液，在玻片上均匀涂开成一薄层即可。对于寄生虫样品或真菌引起的疾病，直接在低倍镜下即可发现虫体或菌丝。对于细菌感染，使用相差显微镜，用高倍物镜课发现大量细菌。无相差显微镜时，使用高倍物镜，通过调节光线强度，一般也能观察到。刮取肠道粘液时，注意不要取样太多，并尽量涂开，以免涂层太厚影响结果观察。
血液涂片适合于检查染虫率较高或出现菌血症时的动物体，此外观察红血球是否完整也是判断是否出现菌血症的一个指标。由于血液中含有大量血球，应保证制成一张均匀的薄片，然后进行观察。血液涂片制备过程简述如下：
（1）取一小滴抗凝血，于洁净载玻片一端3/4处，以另一洁净玻片一端于血滴处，使两载玻片成30º～40º，此时血液立即沿玻片边缘扩散，遍及两载玻片接触处。
（2）以第二载玻片用力均匀将第一载玻片血滴推向另一端，血液随之涂布于第一载玻片上，形成一均匀的血层，空气中干燥数分钟。
（3）加入瑞氏或吉姆萨染液染色，所制得的血片，以涂片上红血球成单层，互相紧接而不重叠为好。涂片的血球厚薄取决于血滴大小，载玻片的角度、用力均匀与否。注意血滴不可太大，动作要迅速，在血液凝固前一气呵成。要制出良好的血片，载玻片必须非常清洁，新玻片应浸泡于10%醋酸溶液中，然后蒸馏水冲洗，干燥后备用。旧玻片应采用洗洁精清洗后于新鲜配制之1/1000硝酸溶液中过夜，用蒸馏水冲洗干净后用酒精浸泡或烘干备用。
（4）压片是最常用的制片技术之一，通常用于检查水生动物鳃丝、鳞片或病灶组织。压片的基本方法为：在洁净载玻片上加一滴蒸馏水，用眼科镊子取少许待检组织，置于水滴中央，用镊子轻轻分离组织，再在待检样品上压上一洁净盖玻片，即可用于观察，观察要点同上，压片注意不要出现气泡，避免气泡出现的最好办法是：盖玻片先以一端与加有待检样品的水滴边缘接触，然后缓慢放入盖玻片使之整体覆盖样品。在制备鳃丝压片时，可轻盖玻片，使鳃丝充分分开，便于观察鳃丝上寄生的生物。
2.切片技术
切片技术在鱼病现场诊断应用较少，更多应用于组织病变中。组织切片要经过固定、脱水、包埋、透明、切片、脱蜡、染色等一系列过程，通常需要3～4天时间，且需要特殊的切片机等设备，一般单位很难满足。对于需要切片的样品或疑难病例，建议采集小块待检组织用10%福尔马林固定后暂存，必要时可委托当地医院或就近研究机构进行切片和观察。
（1）染色技术
染色可使标本中的病原体更易观察，对于不同的病原体，有不同的染色方法。如细菌染色一般采用结晶紫、亚甲基蓝等染液，寄生虫观察则按寄生虫种类可采用不同的染色方法。有关染色技术，可参考专门的文献。
（2）电镜观察样品的准备和送检
电镜观察的标本通常是用戊二醛，通常用磷酸缓冲液或生理盐水配成2.5%～3.0%使用。为固定彻底，电镜固定标本要将组织块浸泡于固定液中后，用锋利的刀片将组织切成大小约为4～5毫米的小块，对于甲壳动物标本，应割破甲壳，现场条件不具备时，也可用注射器将固定液在甲壳动物上各部多点注射，带回实验室后再行处理。固定后标本如马上处理，可保存于固定液中室温保存较长时间，也可保存于4℃。
四、注意事项
1.使用显微镜可以观察到肉眼无法观察到的病原体及相应的病理变化，与解剖诊断相比准确性更高，但应该注意到，显微镜在疾病诊断中的应用也是有局限性的，主要表现在以下几个方面：①常规显微镜的分辨率为0.2微米，这对于寄生虫病得诊断已完全可以满足，但对于细菌来说，显微镜只能大致了解细菌的最基本特征，而不能确定细菌种类，而需要通过较为复杂的细菌鉴定过程。对于病毒这样亚显微结构的病原体，常规显微镜无法观察到，需要费时又昂贵的电镜观察。②显微镜观察结果有一定的相对性，特别是病灶周围观察到大量细菌时，除了细菌病的可能性，还要注意是否由于病毒或其他病原体感染引起的细菌继发感染。因此还需要通过其他依据及实际用药效果来综合判定。
2.在下述情况下需要准备电镜样品
（1）观察未发现寄生虫、真菌、细菌等，而相关组织有明显病变，且呈现明显的流行暴发趋势时，提示可能由病毒引起。
（2）病灶部位肉眼观察病变较为特殊，从发病鱼的种类及发病季节等均提示可能是新的疾病时。
（3）出现新的症状、典型发病症状，有进一步研究病变必要时。由于电镜制备时间较长，而且需要较高的费用，对于常规的疾病，一般均不采用电镜观察。
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