病原微生物耐药性的评价方法

抗生素类药物在水产养殖和育苗中大量应用，在起到防治疾病和提高苗种成活率的同时，也产生了严重的耐药性问题，已经导致水产病害越来越多、死亡率越来越高、治疗效果亦每况愈下，其中细菌性疾病难以彻底治愈的问题尤为突出。细菌的耐药性，是指细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。细菌之所以具有耐药性，主要与它的某些特殊构造及它的遗传变异特性有关。

一、常用渔用抗菌药物的耐药机理

1.β-内酰胺类

β-内酰胺类抗生素由放线菌发酵提取或半合成而制得，各种β-内酰胺类抗生素的作用机制均相似，即内酰胺类抗生素与细胞膜上的青霉素结合蛋白（PBP）结合而阻碍细菌细胞壁粘肽的合成，使之不能交联而造成细胞壁的缺损，致使细菌细胞破裂而死亡。这一过程发生在细菌细胞的繁殖期，因此本类药物为繁殖期杀菌药。

细菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制可概括为：①细菌产生β-内酰胺酶（青霉素酶、头孢菌素酶等）使易感抗生素水解而灭活；②β-内酰胺类抗生素与大量的β-内酰胺酶迅速、牢固结合，使其停留于胞膜外间隙中，因而不能进入靶位（PBPs）发生抗菌作用；③PBPs靶蛋白与抗生素亲和力降低、PBPs增多或产生新的PBPs均可使抗生素失去抗菌作用；④细菌的细胞壁或外膜的通透性改变，使抗生素不能或很少进入细菌体内到达作用靶位；⑤由于细菌缺少自溶酶而出现细菌对抗生素的耐药性，即抗生素具有正常的抑菌作用，但杀菌作用差。

2.氨基甙类

氨基甙类抗生素（aminoglycosides）由氨基糖分子和非糖部分的甙元结合而成，包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素等。共同特点为水溶性好，稳定；氨基甙类口服吸收不良，胃肠道不易吸收，大部分以原形经肾脏排出，只可用于肠道感染。注射给药后效果良好，注射后可分布到体内许多重要器官中。

主要作用机理为干扰信息核糖核酸与核糖核蛋白体30S亚单位结合而抑制肽链的延长，作用于细菌蛋白质合成过程，使之合成异常的蛋白，阻碍已合成蛋白的释放，还可使细菌细胞膜通透性增加，使细胞质内的钾离子、酶等重要生理物质外渗，引起细菌死亡。本类抗生素与β-内酰胺类不同，对静止期细菌的杀灭作用较强，属静止期杀菌剂。高浓度时有杀菌作用，低浓度时有抑菌作用。其抗菌谱主要是革兰氏阴性杆菌，包括肠杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属、柠檬酸杆菌属等。

耐药性主要是细菌通过质粒传导产生钝化酶而形成的。如乙酰转移酶、核苷转移酶和磷酸转移酶，分别作用于相关碳原子上的NH2或OH基团，使之生成无效物。一种药物能被一种或多种酶钝化，而几种氨基糖甙类药物也能被一种酶所钝化。因此，在不同的氨基糖甙类药物间存在着不完全的交叉耐药性。产生钝化酶的质粒可通过接合方式在细菌细胞间转移，使原来不耐药的细菌细胞产生耐药性。

3.四环素类

四环素类是由链霉菌产生或经半合成制取的一类碱性广谱抗生素。四环素类抗生素具有共同的基本母核（氢化骈四苯），仅取代基有所不同。它们是两性物质，可与碱或酸结合成盐，在碱性水溶液中易降解，在酸性水溶液中则较稳定。四环素类可分为天然品与半合成品两类。天然品有土霉素、金霉素、四环素和去甲金霉素等。半合成品有多西环素和米诺环素，前者在我国较为常用。

四环素类抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。四环素类属快速抑菌剂，在高浓度时有杀菌作用。其抗菌机制主要为与细菌核蛋白体 30S亚单位在A位特异性结合，阻止aa-t RNA在该位置上的联结，从而阻止肽链延伸和细菌蛋白质合成。其次四环素类还可引起细胞膜通透性改变，使胞内的核苷酸和其他重要成分外漏，从而抑制DNA复制。抗菌作用强弱一般依次为二甲胺四环素>脱氧土霉素>甲烯土霉素>四环素＞土霉素。

细菌对本类药物的耐药状况较严重，一些常见的病原菌的耐药率很高，同时本类药物间存在密切的交叉耐药性。大肠杆菌和其他肠杆菌科细菌的耐药性主要通过耐药质粒介导，并可传递、诱导其他敏感细菌转成耐药，带耐药质粒细菌的细胞膜对四环素类药物摄入减少或泵出增加。

4.喹诺酮类

喹诺酮类又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，指人工合成的含有4-喹酮母核的一类抗菌药物，其中主要为氟喹诺酮。

抗菌药理作用机制为抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌作用为杀菌型。本品与其它抗生素无交叉耐药性，β-内酰胺类、氨基糖甙类、磺胺类耐药菌株对本品仍敏感。该药随药物浓度增加，抗菌作用增强，呈现剂量依赖性。细菌对该类药自然耐药频率低，无质粒介导间的耐药性发生。相反，在体内或体外的适当环境中，该药可使细菌的质粒破损。口服生物利用度好，具有优秀的药动学性质，体内代谢稳定。

氟喹诺酮类（FQNs）药物为广谱、强效抗菌剂，近年来随着FQNs药物在临床的广泛使用，细菌对此类药物的耐药性成蔓延趋势，耐药的细菌种类不断增多，耐药的程度也趋加重，耐药菌株的感染治疗成为一个严重的问题。药物的耐药机制为： DNA促旋酶的变异，基因突变引起靶位DNA促旋酶的改变是FQNAs药物主要的耐药机制。由于细菌DNA促旋酶基因（gyr A,gyr B）和拓扑异构IV基因（parc、par E）突变，导致密码子的改变，或引入终止密码子，不能产生完整的酶亚基；或形成编码同一种氨基酸的密码子，使所编码的酶亚基发生氨基酸的取代，而影响到FQNs药物与靶位的结合，从而影响细菌对FQNs药物的敏感性。

拓扑异构酶IV的变异，拓扑异构酶IV的改变，产生对药物低水平的耐药，当拓扑异构酶II、IV均发生变化，则耐药程度更大。

5.磺胺类

磺磺胺类药是人工合成的氨苯磺胺衍生物。氨苯磺胺分子中的磺酰胺基上一个氢原子(R1)被杂环取代可得到口服易吸收的，用于全身性感染的磺胺药如磺胺嘧啶，磺胺异噁唑，磺胺甲噁唑等。如将氨苯碘胺分子中的对位氨基上一个氢原子(R2)取代则可得到口服难吸收的，用于肠道感染的磺胺药如柳氮磺胺吡啶等。

抑菌谱广，对金葡菌、溶血性链球菌、志贺菌属，大肠杆菌，产气杆菌及变形杆菌等有良好抗菌活性，此外对一些真菌，衣原体、原虫也有效；细菌对各种磺胺药间有交叉耐药性；磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲噁唑(SMZ)脑膜通透性好，脑脊液内药物浓度高；主要经肝代谢灭活，形成乙酰化物后溶解度低，易引起肾脏损害；不良反应较多，常见有溶血性贫血，粒细胞减少，肝脏损害、肾损害等。由于对氨基苯甲酸对二氢叶酸合成酶的亲和力较磺胺类药物大5000～15000倍，故使用磺胺类药物必须有足够的剂量和疗程，首剂常用加倍量，使血液中磺胺药迅速达到有效的抑菌浓度。

磺胺药是抑菌药，它通过干扰细菌的叶酸代谢而抑制细菌的生长繁殖。与人和哺乳动物细胞不同，对磺胺药敏感的细菌不能直接利用周围环境中的叶酸，只能利用对氨苯甲酸(PABA)和二氢蝶啶，在细菌体内经二氢叶酸合成酶的催化合成二氢叶酸，再经二氢叶酸还原酶的作用形成四氢叶酸。四氢叶酸的活化型是一碳单位的传递体，在嘌呤和嘧啶核苷酸形成过程中起着重要的传递作用。磺胺药的结构和PABA相似，因而可与PABA竞争二氢叶酸合成酶，障碍二氢叶酸的合成，从而影响核酸的生成，抑制细菌生长繁殖。

磺胺药的耐药机制是细菌药物作用靶位改变。由于细菌不能使用外源性叶酸，磺胺类药物可通过抑制二氢叶酸合成酶或二氢叶酸还原酶，使细菌发生叶酸代谢障碍，而发挥抑菌作用。耐磺胺类药物的细菌的二氢叶酸合成酶或二氢叶酸还原酶与磺胺类药物亲和力降低，或靶位酶的合成量增加。因此磺胺类药物有严重的交叉耐药性。

二、病原微生物耐药性的评价

随着水产养殖业的迅速发展，细菌性疾病的危害也日趋严重，是水生动物养殖生产过程中的常见和多发病，为了防治水生动物的细菌性疾病，在养殖生产中经常使用各种抗生素和一些抗菌药物进行预防和治疗，但多次重复使用同类抗菌药物容易引起病原菌产生耐药性从而导致防治无效；对抗生素药物的不正确使用，不仅会导致对水生动物体内的药物残留，还可能引起病原菌产生耐药性和机体内正常微生物菌群失调进而破坏微生态平衡。因此从患病水生动物体内进行致病菌的分离，进而进行常用抗菌药物的耐药性（敏感性）评价，是合理、安全正确选择和使用抗菌药物的关键。

1.病原菌的分离

在细菌致病性、防治药物筛选等多项工作中，常常需要病原菌的纯培养物。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，将使用水生动物病原菌单独分选出来的过程称分离。分离和培养是水生动物细菌病防治工作中最基本的操作技术之一。

将患病水生动物用清水冲洗干净后，用 75％乙醇棉球将体表反复擦拭消毒，用无菌解剖器将水生动物剖开，将接种环酒精灯火焰上烧灼灭菌后，醮取腹水、肝脏、肾脏及血液组织，将取样样本，均匀涂布于平板培养基边缘的一小区处，然后自此开始，向左右两侧划线并逐渐向下移动直至下边缘。划线时，接种环与培养基表面呈45º为宜，角度大时容易划破培养基表面。划线应尽可能直、密、匀以有效的利用培养基，以达到充分分离的目的。平板划线后，将培养皿反扣置放于30℃恒温培养箱，培养24小时。

组织稀释法：将病鱼用清水冲洗干净后，用 75％乙醇棉球将病鱼反复擦拭消毒，用无菌解剖器将病鱼剖开，取腹水、肝脏、肾脏组织充分研碎，取1.0克研碎组织加9毫升无菌生理盐水，稀释度为10-1，然后梯度稀释，分别制得10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等稀释液，各取0.2毫升到肉汤蛋白胨培养基涂布均匀，待琼脂将水分吸干后反扣培养皿，置30℃恒温条件下培养24小时，观察各浓度的菌落生长情况。组织稀释法可以定量计各组织中感染细菌的数量。

从患病水生动物体内分离到细菌后，需通过生理生化指标和分子生物学鉴定，确定是病原菌后，再继续进行耐药性的评价。病原微生物耐药性一般采用药敏试验和最低抑菌浓度来评价。

2.病原微生物耐药性的评价方法（药敏试验）

（1）纸片琼脂扩散法

纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer试验（K-B法），是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，二抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。

水解酪蛋白琼脂培养基(MH)是兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，p H 值 7.2～7.4，对那些营养要求高的细菌如链球菌等需加入血清等补充物质。琼脂厚度为4毫米。配制琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。

抗菌药物纸片选择直径为6.35毫米，吸水量为20微升的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含量达到规定所示。也可用商品化的药敏纸片。含药纸片密封储存 2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻储存，且不超过l周。使用前将储存容器移至室温平衡l～2小时，避免开启储存容器时产生冷凝水。

从水生动物分离培养的菌落，在营养琼脂或肉汤培养基中培养16～18小时，然后挑取纯培养菌落或使用液体培养的菌液，悬于3毫升生理中，混匀后与菌液比浊管比浊，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。校正浓度后的菌液应在15分钟内接种完毕。

接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5分钟，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面每张纸片间距不少于24毫米，纸片中心距平皿边缘不少于15毫米；③贴完药敏纸片后，将平皿反转，置30℃恒温培养箱中培育18～24小时后测量抑菌圈大小（彩图44）。

结果判断和报告：用精确度为1毫米的游标卡尺量取抑菌圈直径(抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域) （彩图45）。抑菌圈直径≤10毫米为耐药，直径≥15毫米为敏感， 11～14 毫米为中度敏感(具体参照说明书)。对在抑菌圈内有散在菌落生长的，则可能是混合培养，必须再分离鉴定及试验，也可能提示为高频突变株。

（2）稀释法

如果要进一步检测某种病原菌对多少剂量(浓度)的抗菌药物呈敏感时，就必须使用稀释法。稀释法包括两种：肉汤稀释法和琼脂稀释法，目前主要采用肉汤稀释法。

培养基：普通肉汁胨培养基。

菌液的制备：用接种环沾取纯化的试验菌株，接种到肉汁胨培养基上，28℃培养18小时后，将菌液稀释到2×106CFU/毫升。

测定方法：取灭菌试管10支，无菌操作每管加灭菌生理盐9毫升（第1管）、5毫升（第2～10管）。无菌操作吸取已稀释待测抗菌药物1毫升放入第1管，混匀后吸取5毫升放入第2管中，混匀后吸取5毫升放入第3管中，以此作逐管稀释第9管，混匀后吸取5毫升弃去，第10管不加药物作对照。

每管加稀释的菌液0.5毫升，混匀后28℃培养。24小时后移取1毫升至无菌肉汁胨培养基中，培养24小时后肉眼观察，无细菌生长试管中最低药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。

3.药敏试验注意事项

水解酪蛋白琼脂平板应用90毫米平皿，琼脂厚为4±0.5毫米（约25～30毫升培养基），制备好的平板应在4℃保存，5日内用完；药敏纸片须在放有干燥剂的容器内低温保存，注意药敏纸片的有效期，过期应弃去。菌液浓度也可影响试验结果，浓度大细菌多时抑菌圈减少，菌量少抑菌则偏大，因此菌液配好后应在15分钟内用完，试验过程应严格无菌操作。

在进行耐药性试验时，可用金黄色葡萄球菌ATC25923、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下与常规试验相同的方法测定对同种抗菌药物的敏感性，标准菌株的MIC和抑菌圈大小应在预期范围内，如超出范围，则需重新进行耐药性试验。

0.5%麦氏比浊管配制方法：

0.048摩尔 Ba Cl2(1.17% W/V Ba Cl2.2H2O ) 0.5毫升

0.18摩尔 H2SO4( 1% V/V ) 99.5毫升

将两液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，室温暗处保存，用前混匀，有效期为6个月。

三、抗菌药物治疗的基本原则

正确选择药物，药敏试验是抗菌药物选择的基础之一，是正确选用抗菌药物的先决条件。检测抗菌药物对病原菌的感受性，通常采用抑菌圈的大小、最低抑菌浓度（MIC）作为抗菌效力的评价指标，即通过MIC和抑菌圈的大小来判断使用某种抗菌素是否有效。因此在水生动物发病的初期就需确定致病菌的种类、形态及生理生化指标，测定细菌对药物敏感性。同时应熟悉抗菌药物的抗菌谱、抗菌活性、临床药理、适应症及可能产生的不良反应，结合具体情况合理用药。在药物选择时应选用水生动物无公害养殖生产中允许使用的药物，严格禁止使用国家明令禁止的药物。只有这样才能做到对症下药，避免药物浪费，降低养殖生产成本，增强防治疾病的效果，同时可以避免耐药菌株的产生及药物在水生动物体内的残留，及滥用药物对渔业生态环境造成的污染。

但如果水生动物病害发生过程出现以下情况时也可采用经验性治疗：①病害已开始造成水产养殖动物大量死亡时；如果治疗延迟到获得培养结果后再进行治疗，那么本来威胁不大的感染可能会加剧。②水生动物疾病的外观症状和解剖非常典型，能作出准确判定时。③致病菌可预测到，即使治疗失败，所引起的危险性不大时。但由于经验性治疗效果不具有肯定性，因而对疾病的治疗一般须采用广谱抗菌药物，以覆盖较多的病原菌。

当感染致病菌种类已确定，药敏试验已获结果，即可选择抗菌药物进行特定性治疗。这种治疗方案具有肯定性，可结合抗菌活性、药动学特征、药效学、不良反应、药源及价格等综合考虑。其目标应具有最大治疗效果并降低养殖生产成本、降低水生动物的药物残留。当应用窄谱抗生素治疗已足够时，应可能采用，这样既可使用药成本低廉，又较安全。如果病情严重，或混合感染，则应采用联合抗菌治疗，即在拌饵投喂抗菌药物的同时，对养殖水环境进行消毒处理。同时密切观察，避免盲目地用药。当治疗方案失败时，则须进一步研究病因，对不常见的病原学需寻找不同的特殊治疗。