鱼类疫苗的免疫效价和保护率的测定方法

一、草鱼出血病细胞疫苗的质量控制

外观：该疫苗外观呈红色或淡红色，摇匀略呈混浊。

纯粹性检验：该疫苗涂布于普通琼脂平板上，28℃培养18～24小时后，平板上无杂菌生长。

安全试验：取疫苗，加入同体积生理盐水，注射规格10厘米/尾，草鱼5～10尾，0.2～0.3毫升/尾，28～30℃水簇箱中饲养，7天内无死鱼，即属安全疫苗。

免疫保护率测定：取疫苗，加入同体积生理盐水，注射规格10厘米/尾，草鱼20～40尾， 0.2～0.3毫升/尾，网箱饲养30～60天，注射草鱼出血病病毒悬液0.2～0.3毫升/尾，测定时设3个攻毒试验组和3个对照组，每组注射草鱼种10尾，28～30℃水簇箱中饲养7～15天，统计死亡率。注射免疫保护率为80%以上时为合格疫苗。免疫保护率按以下公式计算：

二、嗜水气单胞菌菌苗的质量控制

外观：该疫苗外观呈淡黄色，瓶底有白色沉淀，摇匀呈均匀混浊。

纯粹性检验：该菌液涂布于普通琼脂平板上，28℃培养18～24小时后，平板上无嗜水气单胞菌和其它杂菌生长。

细菌浓度：细菌浓度按半成品检验中菌含量测定方法进行，菌浓度应≥50×108CFU/毫升。

安全性检查：取成品菌苗稀释至50×107CFU/毫升，腹腔注射10尾健康的鲫鱼，注射剂量按鱼体的大小，每尾注射为0.2～0.5毫升注射后在水温28～30℃水簇箱内饲养7天，同时设空白对照。要求菌苗注射后，鲫鱼的成活率为100%。

免疫保护力的测定：取上述菌苗，注射同规格鲫鱼20～40尾，0.2～0.5毫升/尾，网箱饲养30～60天后，用同源的强毒株菌种攻毒后，28～30℃水簇箱中饲养7天，统计死亡率。注射免疫保护率为80%以上，浸泡免疫的保护力为70%以上的疫苗为合格疫苗。

免疫保护率按以下公式计算：

三、草鱼出血病疫苗效价测定

取疫苗，加入同体积生理盐水，注射10厘米规格草鱼20～40尾，每尾0.2～0.3毫升，饲养于网箱内30～60天后，捕出后，取液样品并分离血清。ELISA测定。

用ELISA法检测抗体的效价 按照Adams and Thompson, (1990)的方法进行。即于96孔板上每孔加100微升 0.001%的多聚L赖氨酸的碳酸氢钠缓冲液，包被1小时，用低盐洗涤缓冲液(LSWB)冲洗3次，再于每孔加100微升病毒样品，4oC冰箱过夜。LSWB冲洗，加250微升 1%牛血清白蛋白(BSA)或3%的脱脂奶封闭，室温放置1小时，LSWB冲洗，加用PBS作二倍系列稀释的鱼血清，4℃冰箱过夜，以免疫前血清或PBS为阴性对照。次日用高盐缓冲液(HSWB)冲洗，最后一次冲洗时放置5分钟并甩干。加100微升鼠抗草鱼Ig M的单克隆抗体，温育1小时HSWB冲洗，加100微升用抗体缓冲液1∶100稀释的兔抗鼠Ig G辣根过氧化物酶(HRP)，温育1小时。用TTBS冲洗3次，加100微升底物显色液约10分钟，加50微升2M的硫酸终止反应，在ELISA读数仪上于波长450处读数。