组织学与胚胎学的研究技术

随着科学技术的发展,组织学与胚胎学的研究技术不断更新,每一类技术又含许多分支技术,有的操作程序十分复杂,所用仪器极其精密,其原理涉及物理、化学、生物化学、免疫学、分子生物学等学科的知识。现对几种主要技术简要介绍。

(一)光学显微镜术

石蜡切片术(paraffin sectioning)是经典而最常用的技术。其基本程序为:①取材和固定——新鲜的组织切成小块(不超过1.0cm),用蛋白质凝固剂(如甲醛或乙醇)固定,以保持组织的原本结构;②脱水和包埋——把固定好的组织块用乙醇脱水,再用二甲苯浸泡透明,将组织块置于融化的石蜡中浸蜡,冷却后变成为组织蜡块;③切片和染色——将包有组织的蜡块用切片机切为5~7μm的薄片,贴于载玻片上,经脱蜡等步骤后进行染色。最常用的染色法是苏木精、伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE),简称HE染色法。苏木精为碱性染料,将细胞核内的染色质与胞质内的核糖体染为紫蓝色。被苏木精染为紫蓝色的结构称为嗜碱性(basophilic);伊红为酸性染料,将细胞质和细胞外基质中的成分染为红色。被伊红染为红色的结构称为嗜酸性(acidophilic);如果与两种染料的亲和力都不强,则称中性(neutrophilia);④封片——切片经脱水、透明处理后,滴加树胶,用盖玻片密封保存。

(二)电镜技术

电子显微镜(electron microscopy,EM)简称电镜,是用电子束代替光线,用电磁透镜代替光学透镜,用荧光屏将肉眼不可见的电子束成像。

1.透射电镜术(transmission electron microscopy,TEM) 是用电子束穿透样品产生物像,显示细胞内部的超微结构(ultrastructure),电镜的放大倍数可达数万至数十万倍,分辨率可达0.2nm。由于电子束易被散射或被样品吸收,穿透力低,所以观察时须制备超薄切片(50~80nm)。制备程序和石蜡切片相仿,但要求极严格。一般须迅速取材,组织块(1mm3以内)用戊二醛与锇酸2次固定,脱水后树脂包埋,用超薄切片机切片,再经醋酸铀和柠檬酸铅电子染色。然后再在电子显微镜下观察,当电子束射落到切片时,随细胞构成成分的密度以及吸附重金属铀、铅、锇的程度不同,而发生相应的电子散射。当电子束投射到密度大、吸附重金属多的结构(如溶酶体)时,电子被散射得多,因此,射落到荧光屏上的电子少,电镜照片上显色较暗,称电子密度高;反之,显色呈浅灰色,称电子密度低。

2.扫描电镜术(scanning electron microscopy,SEM) 主要用于观察组织、细胞和器官表面和立体结构。组织块(约0.3cm大小)用戊二醛与锇酸固定后,经脱水、干燥,再于其表面喷镀薄层碳与合金膜。电镜观察时,电子束在标本表面扫描,在荧光屏上显示标本表面的立体构像。故标本图像具有真实的立体感,其分辨率低于透射电镜,一般为5~7nm。

图绪-1　光学显微镜的构造

(三)放射自显影术

放射自显影术(autoradiography)是通过活细胞对放射性物质的特异性摄入,以显示该细胞的功能状态或该物质在组织和细胞内的代谢过程。首先,将放射性核素标记的物质注入动物体内;间隔一定时间后取材和制片,并在其上涂以薄层感光乳胶,置暗处曝光,细胞内放射性核素产生的射线使乳胶感光,再经显影、定影、复染,在放射性核素或其标记物存在的部位,溴化银被还原为黑色的微细银粒,经光镜或电镜下观察,从而研究被检测物质在组织和细胞中的分布及相对含量。

(四)组织化学术

组织化学术(histochemistry)是应用物理、化学反应原理,显示组织切片活细胞内的某种化学成分的数量以及分布状态,从而研究与其有关的功能活动。组织化学分为以下3类。

1.一般组织化学术 基本原理是在切片上滴加某种试剂,与组织中的某种物质发生化学反应,并在原位形成有色沉淀产物,通过观察该产物,对某种化学物质进行定位、定性及定量研究。

2.免疫组织化学术(immunohistochemistry) 是根据抗原与抗体特异性结合的原理,检测组织中肽和蛋白质的技术。如把人或动物的某种肽或蛋白质作为抗原注入另一种动物,其体内会产生针对该抗原的特异性抗体(免疫球蛋白)。将抗体从动物血清中提出后,与标记物相结合,即成为标记抗体。用后者处理组织切片活细胞时,标记抗体则与组织中相应抗原特异性结合,通过在显微镜下观察标记物了解该肽或蛋白质的分布部位。

3.原位杂交组织化学术(in situ hybridization histochemistry) 是一种在组织细胞原位进行的核酸分子杂交组织化学技术,用以研究基因在染色体上的定位,或编码某种蛋白质的m RNA在胞质中的表达,其敏感度高,特异性强。原理是用带有标记物的已知碱基顺序的核酸探针,与细胞内待测的核酸按碱基配对杂交,然后通过对标记物的显示和检测,而获知待测核酸的有无及相对量。

(五)细胞培养术和组织工程

细胞培养术(cell culture)是将活的细胞在体外模拟体内的条件下进行培养的技术。组织工程(tissue engineering)是用细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。目前正在研究构建的组织器官主要有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管、角膜等,其中以组织工程皮肤和软骨较为成功,临床上用于治疗烧伤、皮肤溃疡等疾病。

(牟兆新)