显微镜的成像深度（景深）

11.3.5　显微镜的成像深度（景深）

通过显微镜观察的物体通常都有一定的厚度。当显微镜调焦于某一物平面（称基准平面）时，在其前后能被观察者看清楚的两个最远平面之间的轴向距离Δl，即为显微镜的成像深度，又称为“景深”或“场深”。

从理论上分析，显微镜的成像深度（Δl）受到以下三方面因素的影响，即有：

Δl=Δl_g+Δl_w+Δl_m　　　　　　　　　　（11.21）

上式中，Δl_g反映几何景深的影响；Δl_w反映物理景深的影响；Δl_m则反映人眼调节能力（远点、近点）对景深的影响。以下分别作简要讨论。

1）显微镜清晰成像的几何深度——几何景深（Δl_g）

在图11.8中，设显微镜出瞳位于像方焦面上，眼睛在出瞳处观察，M＇是基准像平面，M₁＇是基准物平面M的邻近平面M₁的像，M₁＇相对于M＇的距离为dx＇。A₁＇点的成像光束在基准像平面M＇上截出的弥散斑直径Z＇。由图中几何关系应近似有（dx＇《x＇）：

当直径为Z＇的弥散斑对出瞳中心（亦即眼瞳中心）的张角ε（Z＇=x＇ε）恰好等于人眼的视角分辨率时，由此对应的dx＇的二倍即可视为基准像平面前后能成清晰像的两个像面之间的几何深度

2dx＇在物空间对应的轴向距离2dx即为显微镜能成清晰像的物空间深度（即几何景深）Δl_g

将如下的轴向放大率代入上式，并注意到n＇=1，，则有

上式表明，几何景深与显微镜的视放大率Γ及显微物镜的数值孔径成反比，Γ和NA值越大，则显微镜的几何景深越小。

图11.8　显微镜的几何景深

在上式中，ε值是以弧度为单位的。若转换为以分为单位（1＇=0.000291弧度），并按照具列克的建议取ε=5＇，代入上式则有

2）物理景深

根据衍射理论，一个点被理想光学系统所成的像为一个衍射光斑。当像面离焦时，衍射图样的能量分布将发生变化。由允许衍射图样能量分布变化所决定的物面轴向移动量Δl_w称为显微镜的“物理景深”。它满足如下关系：

上式：λ——以mm表示的光波长。

3）调节景深

上述显微镜成像深度的计算公式，是在假定眼睛水晶体不作调节的情况下得到的。实际上眼睛具有调节能力，通过调节可以看清楚在眼的近点和远点范围内的像。

图11.9　正常眼的调节景深

若以SD_近、SD_远和SD分别表示人眼的近点、远点和调节范围的视度值；而以l_近、l_远分别表示近点和远点到眼瞳的距离（以m为单位），则应有：

对正常眼，远点位在无限远，l远=∞，因此有

当显微镜成像在无限远时，物平面位在显微系统的物方焦面上；当眼睛通过调节看清近点A＇时，对应的物点位置从F点移至A点（见图11.9），移动量为x，则x即为眼

睛通过显微镜观察时的调节景深，以Δl_m表示，利用牛顿公式应有

将x＇=1000l_近=1000/SD_近和f＇=250/Γ代入上式得到

上式中SD为人眼的调节视度。正常眼最大调节能力为10视度，而一般由无限远到明视距离（－250mm）范围内可以毫不费力地进行调节，因此取SD=－4（l近=－250mm），代入式（11.28）有

综合以上三方面因素，在不重新调焦的条件下，显微镜物空间总的清晰成像深度应为

上式表明，当使用高倍和较大数值孔径的物镜工作时，显微镜的清晰成像深度是很小的；其基本规律是成像深度与显微镜的视放大率Γ以及物镜的数值孔径NA成反比，并且数值孔径的影响比视放大率的影响更重要得多；另外，对厚度大于成像深度的标本，需要利用微调机构，依次对不同深度的层面调焦。

表11.3按只考虑式（11.30）前两项之和计算了一些常用数值孔径和放大倍率下显微镜的景深，计算中对NA＜1.0的干物镜取n=1.0；对NA≥1.0的浸液物镜取n=1.5。

表11.3　部分常用数值孔径和放大倍率下的显微镜成像深度（μm）

表11.4计算了式（11.30）中第三项的影响，即眼的调节深度（取n=1.0，对浸液物镜表中数值应乘积以1.5）。

表11.4　眼的调节深度（n=1.0）

比较两表可以看出，眼的调节深度的影响在使用低倍显微镜时可能是重要的；而在使用高倍显微镜时，其影响成为次要因素。

图11.10　显微镜成像深度与Γ及NA的关系曲线

图11.10按n=1.45、λ=550nm计算并作出了显微镜的成像深度与显微镜的放大率Γ以及数值孔径NA的曲线关系（未考虑眼的调节深度的影响）。

实际使用中为获得较大的景深，以便能同时看清标本整个深度范围内的微观组织情况，常采用较低倍物镜与较高倍目镜组合的方案。

如果将显微镜成像结果进行照相或投影至屏上，则式（11.30）中的第三项不存在，即有

（11.31）