11.5.2 主要的照明方式与照明系统
如前所述，显微镜的照明方式从不同的角度可以区分为：透射式与反射式；明场照明与暗场照明。实际使用中最大量应用的是明场的透射照明和反射照明。
1）明场照明
这是在生物和金相显微镜中得到普遍采用的照明方式。它是利用照明系统发出的光直接照射到物体上，经透射或反射后，被显微物镜成像，其成像和鉴别是以标本与周围介质以及标本内部各点之间的亮暗和颜色反差为基础的。明场照明方式具体又分为明场透射式照明与明场反射式照明。
（1）明场透射式照明
大多数生物显微镜都采用明场透射照明的方式，即将透明标本夹于载物玻片和盖玻片之间，然后以透射光照明透明的标本进行观察；部分标本有时需进行染色处理以取得较好的观察效果。根据显微镜倍率和对照明效果要求高低的不同，照明方法可区分为如下三类：
①直接照明
普通生物显微镜常在显微镜的下部设置平面镜成凹球面反射镜，利用自然光源或灯光对物面进行直接照明。为了充分利用显微物镜的数值孔径，光源必须有足够大的尺寸。这种情况对利用天空、白云等自然光源照明也是不成问题的，只要使平面镜框绕相应的轴线旋转至对准自然光源的方向即可；但在光源尺寸有限的情况下，保证照明光束有足够的孔径角以与显微物镜的数值孔径相匹配，和保证物面照明的均匀性之间是存在矛盾的。如图11.19（a）所示，为了增大照明孔径角u1使之达到u，必须将光源移近物面到达A1＇A2＇处，或者将其尺寸增大至A1″A2″；然而从保证物面照明均匀的角度出发，又要求光源面适当远离被照明物体。为保证照明均匀，在一定照明孔径角的条件下尽量减小光源面尺寸，可采用凹球面反射镜，如图11.19（b）所示。
②临界照明
由于亮度大的实际光源其尺寸均不大，并且不能太靠近标本平面，因而不能使照明光束充满物镜孔径。为增大照明光束的孔径角，可以采用适当焦距和孔径的聚光镜系统，将光源以缩小的比例成像在物平面上。由于垂轴放大率β＜1，因而聚光镜系统的角放大率γ＞1；为使显微物镜的数值孔径得到充分利用，应使聚光镜的数值孔径等于或稍大于显微物镜的数值孔径。
图11.19 光源直接照明方式的照明光束与成像光束匹配
将光源面通过聚光镜成像在物平面上的照明方法称为“临界照明”。图11.20（a）是临界照明光路的基本结构。如果忽略损耗，光源像的亮度应该等于光源的亮度，因此，这种方法的实质就相当于把光源放在物平面上。光源像的周界起到视场光阑的作用，视场光阑像与显微镜的物平面重合，在物面被照明的视场范围内有最大亮度；直径可变的孔径光阑通常设在聚光镜的物方焦面处（或其附近），因而聚光镜的出瞳在无穷远处。改变孔径光阑的大小，即可改变聚光镜的像方孔径角，使之满足物镜数值孔径的要求。如果显微系统的孔径光阑设在物镜的像方焦面处（或其附近），则显微系统的入瞳亦在无穷远处。在上述条件下，照明系统的出瞳与显微系统的入瞳重合，即满足两个系统之间的“光瞳衔接原则”，因而照明光束将得到充分的利用。当更换物镜时，聚光镜的孔径光阑要作相应的调整，以始终保持照明系统的像方孔径角与显微物镜的数值孔径相适应。如果照明系统像方孔径角太小，则不能充分发挥物镜的数值孔径的作用；反之，太大也会造成有害的杂散光影响。
有些情况下，根据使用和结构的需要，照明系统的聚光镜也可用两组取代。其中，前组靠近光源称为集光镜；后组靠近标本，称为聚光镜，两者之间为平行光路，如图11.20（b）所示。
在显微镜高倍工作条件下，物方线视场很小，因此如图11.20（a）所示的临界照明系统得到的光源像虽然很小，但仍可满足要求；当显微镜工作于低倍条件下时，物面上需要有较大的均匀照明范围，这就要求照明系统应在物面上成一较大尺寸的光源像。为此可采用如图11.20（c）所示的照明系统，它可视为图11.20（a）的复杂化。如果需要改变照明视场的大小，可调节视场光阑。
临界照明的缺点是，光源（灯丝）像亮度的不均匀性将直接反映到物面上，影响观察效果。
③柯勒照明
为了消除临界照明物面亮度不均匀的缺点，柯勒在显微镜的照明上，采用了如下方法（参见图11.21物平面前方的系统）：将光源（最好在光源后面放毛玻璃）通过集光镜成实像在聚光镜的物方焦面处，该面上设置可变孔径光阑；光源的一次像经聚光镜成像在物镜的入瞳即无穷远处，因而满足光瞳衔接原则；集光镜被光源照明后，成为一比较均匀的发光面，在其出射面处（或其附近）设置可调节的视场光阑，该发光面与视场光阑经聚光镜成像在物平面上。因此，自聚光镜出射的平行光束均匀地照明被视场光阑像所限定的物面（视场）范围。按上述关系排列的照明光路为“柯勒照明”。
图11.20 临界照明方式的几种光路结构方案
柯勒照明的优点首先是视场内照明均匀，这是因为物平面上的每一点均受到光源上所有点发出的光线照射；同时，光源上每一点发出的照明平行光束，又都交会重叠到物平面上的同一视场范围；另外，调节孔径光阑和视场光阑可以分别有效地控制照明光束孔径和照明视场的大小而互不干扰。因为调节孔径光阑只改变聚光镜像方出射光束孔径角的大小，而不改变照明视场的大小（这是因为通过视场光阑边缘和视场中心的光线同时通过孔径光阑中心的缘故）；反之，调节视场光阑大小时，只影响物平面上被照明区域的大小，而不改变照明光束孔径角的大小，因为与光轴成um角的边缘光线通过视场光阑的中心。
柯勒照明系统在具有内装光源的显微镜中（如实验室、研究用的生物和金相显微镜等）获得普遍采用。
图11.21表示了具有柯勒照明系统的明场透射式显微镜照明与成像的简化光学原理图。整个系统安排在一条直线上，图中各部件均以单薄透镜取代。
（2）明场反射式照明
观察金属、矿物等不透明标本时，需采用反射光照明装置。这种系统的基本结构与透射式照明系统相同；区别是：光路中加入分光镜，以使照明系统与观察系统重合，物镜本身兼做聚光镜，照明光束通过物镜投射到标本上，如图11.22和图11.23所示。这样，如果试样表面为抛光镜面，则自镜面反射的光线全部进入物镜成像，在目镜视场中看到的是明亮一片；如果试样抛光表面上有一些被侵蚀的凹坑，则这些被侵蚀组织上所产生的漫射光线很少能进入物镜成像，因此在视场中看到的将是在一片亮背景下的一些黑色侵蚀坑的像。
图11.21 柯勒照明方式与显微成像原理结构
图11.22表示了垂直投射的、明场反射式临界照明系统。这种照明系统的特点是光源经整个照明系统后成像在标本平面上，因而照明是不均匀的；图11.23是应用于金相显微镜中的垂直投射的、明场反射式柯勒照明系统，光路为倒置式。其特点是，光源成像在物镜的孔径光阑上而非试样表面上，物镜是照明系统的一部分，并以平行光束照明试样表面，因而照明是均匀的。图中两聚光镜之间的平行光路以及辅助透镜的加入均是为了满足一定的光学机械结构要求。
图11.22 明场反射式临界照明系统
图11.23 明场反射式柯勒照明系统
（3）明场照明系统中的部件
照明系统主要由光源、集光镜和聚光镜等部件组成。与显微镜的成像系统相比，照明系统部件对像差的要求要低一些，通常主要是校正球差、色差，满足等晕条件。下面分别介绍集光镜和聚光镜。
①集光镜
如图11.21所示，集光镜位于光源附近，起到会聚光源发出的光能的作用。根据柯勒照明要求，它将光源成放大像在聚光镜的孔径光阑平面上（反射光照明时，成像在与显微镜出瞳共轭的平面上），以保证照明的均匀性。
图11.24 柯勒照明系统集光镜外部参数计算
下面举例计算按柯勒照明方式的集光镜外部参数（见图11.24）。设照明系统的非浸液聚光镜f聚＇=10.5mm，数值孔径NA= 0.25，被照明物体直径2y=1.0mm，光源尺寸2y0=1.7mm。另外，给定集光镜与位于聚光镜前焦面处的可变光阑的距离为l0＇= 210mm。
设集光镜和聚光镜均可视为薄透镜，根据物像空间的正弦条件公式，对集光镜和聚光镜应分别有
y0sinu0=y0＇sinu0＇
hsinu=h＇sinu＇
将y0sinu0和hsinu近似看作光学系统的物像空间不变量（系统位在空气中），可以得到
y0sinu0=h＇sinu＇=ysinu＇
上式亦可表示为
y0NA0=yNA
式中NA0、NA分别为集光镜和聚光镜的数值孔径。由此可得集光镜的数值孔径为
聚光镜孔径光阑的直径应为
DA=2y0＇≈2f聚＇sinu＇=2×10.5×0.25=5.25（mm）
集光镜应使光源恰成像在聚光镜的孔径光阑上，其放大率应为
集光镜的焦距值应为
灯丝到集光镜的距离
紧靠集光镜的视场光阑大小应为
集光镜光学结构的复杂性取决于它的数值孔径、放大率和光源尺寸。通常集光镜与灯泡、照明系统的视场光阑一起装在显微镜镜架的底座中。
②聚光镜
聚光镜的位置靠近标本平面，用以照明标本。其光束的数值孔径应与显微物镜的数值孔径相匹配。通常聚光镜是显微镜可拆卸的独立部件。
明场照明的聚光镜有如下几种结构型式：
·单透镜聚光镜。一般和数值孔径小于0.3的显微物镜配合使用，或作为较复杂聚光镜系统中的组元。通常将其球差校正至最小。
·双透镜聚光镜。应用最普遍的显微镜明场聚光镜是如图11.25（a）所示的阿贝双透镜聚光镜，它是由一平凸的半球透镜和一个双凸透镜组成的。其优点是可以设计成具有较高的数值孔径，与任意的消色差物镜配合使用；另外，它有较长的焦距，因而在较小尺度光源的条件下，即可将一个低倍（例如10倍）物镜的视场覆盖。由于其结构简单，因而被广泛应用于与20×0.40～90×（1.2～1.5）的一套显微物镜配合使用。在高倍工作条件下，可采用浸液式阿贝聚光镜，其数值孔径可达1.2～1.5。
阿贝聚光镜的不足之处是，由于结构简单，因而不能得到较高质量的像差校正结果。
·三透镜浸液聚光镜。在阿贝双透镜聚光镜的两组元之间，增加一个齐明弯月透镜，如图11.25（c）所示，可以使数值孔径增大至1.4。
·消色差型聚光镜。如图11.25（d）所示。
·消色差齐明浸液聚光镜。如图11.25（e）所示。其数值孔径可达1.4，像差校正的结果接近于消色差显微物镜，可以实现对彩色传递的较高要求，主要应用于研究型显微镜中。
图11.25 聚光镜的几种结构形式
虽然通过调节孔径光阑和视场光阑可以控制照明光束孔径和视场的大小，但是，用同一聚光镜对从低倍到高倍差别很大的显微物镜视场进行照明，并实现数值孔径的完全匹配是不可能的。以阿贝型聚光镜为基础，当从显微物镜高倍小视场的工作条件变换为低倍大视场时，可采用如下几种方法：
①从聚光镜组（见图11.25（a）的阿贝聚光镜）移去前透镜（半球透镜），使余下的透镜成为孔径小而视场大的聚光镜。此时，对聚光镜必须重新调焦，以在物平面上得到视场光阑的清晰像。
②在阿贝聚光镜组的孔径光阑下面加入一个适当倍率的场镜。
③移动阿贝聚光镜的双凸透镜（见图11.25（b）），实现变倍。
2）暗场照明
其基本原理是：利用特殊的照明系统实现斜射的照明条件，使主要的照明光线完全不能进入物镜，能够进入物镜成像的只是由被检物体表面的一些微粒散射或衍射的光线。因此，在暗场照明条件下，从目镜视场中看到的是在黑暗背景上有一些亮的质点或微粒，如同观察夜空中的星星。
暗场照明的特点是：照明光束以极大的倾斜角照射到标本的表面上，即照明光束通过物镜的周围照明标本，物镜不是照明系统的组成部分。
暗场照明的优点是：像场的反差好，因而可以提高分辨率，观察到在普通明场显微镜中看不见的0.2～0.004μm范围内的超显微粒子的存在。通常多用于观察非染色的生物细菌、细胞等活体以及金属试样表面被侵蚀的组织等。但是，由于暗场观察物像的亮度较低，因而应采用强的光源。根据照明的具体方式，暗场照明又可分为：
（1）透射式暗场照明
获得对透明物体进行暗场照明的比较简单而直接的方法是中心挡光法，即利用遮光屏，挡住折射聚光镜照明光束的中央部分，使之不能照射到标本上；而能透过标本的照明光束却不能进入显微物镜孔径，从而形成暗场，如图11.26（a）所示。这种方法对小于0.65NA的较低数值孔径物镜可以获得较满意的效果，但缺点是有较严重的反射光。
图11.26 透射式暗场照明
对于具有浸液和较高工作倍率的物镜，利用普通显微镜的聚光镜是不合适的，因为要使来自聚光镜的照明光束不能进入物镜，必须使聚光镜有较大的光束孔径角，即要求聚光镜的数值孔径（NA）cd大于物镜的数值孔径（NA）ob。对折射式聚光镜要达到较高数值孔径，其像差校正是困难的。为此，通常暗场聚光镜采用反射式系统。图11.26（b）是最简单的具有旋转抛物面型的反射式暗场聚光镜。轴向平行光束的中央部分被挡光屏遮蔽，周围部分经抛物面反射后，会聚于抛物面的焦点上。玻璃载片必须不超过一定的厚度，并且在和聚光镜面之间应有适当的浸液，以确保光线射出聚光镜并被聚焦于标本上。抛物面型反射聚光镜广泛应用于对活体微生物的医学研究之中。图11.26（c）是一种比较复杂的心脏形暗场聚光镜，聚光镜是由同一牌号的两块玻璃制成，玻璃常数接近于载物玻片和浸液常数，聚光镜的入射面和出射面是平面；聚光镜的圆环反射面是心脏线形回转面。这是一种产生齐明像的最完善的反射式聚光镜。反射式暗场聚光镜主要用来和具有较高数值孔径的浸液物镜相匹配。一般地，物镜的数值孔径必须控制在1.0或略低一点。
（2）反射式暗场照明
暗场照明亦可应用于对不透明标本的检验。如图11.27所示，空心的照明光束环绕在物镜的周围，以极大的倾角投射并聚焦在不透明试样的抛光表面上，经镜面反射后不能进入物镜成像，因而形成暗背景；如果抛光表面上有被侵蚀的组织或微粒，则由它们漫反射的光线中有一部分将进入物镜成像，从而形成暗背景上的亮像。图11.27（a）和图（b）分别表示了由圆环状反射式和透射式（透镜或棱镜）暗场聚光镜对不透明物体的暗场照明。
图11.27 反射式暗场照明
【注释】
(1)优先数和优先数系是国际上一种科学的、统一的数值制度，适用于各种量值的分级，特别是产品的参数和参数系列的确定。它是一种无量纲的分级数系，优先数系中每一个数值均为优先数。
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