微分脉冲极谱法测定秋水仙碱

实验6　微分脉冲极谱法测定秋水仙碱

一、目的

通过微分脉冲极谱法对秋水仙碱药片进行定量分析，掌握微分脉冲极谱法的特点及实验方法。

二、内容提要

秋水仙碱（Colchicine）（C₂₂H₂₅O₆N，M＝399.45）是从秋水仙的球茎中分离得到的一种酰胺类生物碱，化学名为N－（5，6，7，9－四氢－1，2，3，10－四甲氧基－9－氧－苯并［a］环庚三烯并环庚三烯－7－基）乙酰胺。结构式

秋水仙碱对细胞有丝分裂具有明显的抑制作用，能抑制癌细胞的增长。临床上用于乳腺癌、皮肤癌、白血病等的治疗，也用于研究艾滋病（AIDS）的治疗。秋水仙碱的测定方法，如容量滴定法、电位滴定法、紫外分光光度法、荧光分析法和高效液相色谱法等，手续均不太简便。使用电化学分析法的阳极伏安法和交流极谱法，前者因使用固态电极重现性较差，后者用非水溶剂作为介质，灵敏度不高。使用微分脉冲极谱法测定，方法简便，结果良好。

微分脉冲极谱法（DPP）与经典直流极谱法的差别，在于对工作电极加电压的方式的不同。它是在线性变化直流电压上，在每滴汞下落之前施加一个脉冲振幅相同的矩形脉冲电压，脉冲宽度为40～80ms，脉冲振幅为5～100mV之间。在脉冲施加前20ms和脉冲终止前20ms内测量电流，记录两次电流差值，可获得呈峰形的微分脉冲极谱图，如图3－17所示。由于该方法是在汞滴脱落前的一瞬间（即取样时间）测量发生信号，此时充电电流已得到充分的衰减，因而很好地消除残余电流，提高了信噪比。

图3-17　由CHI821电化学分析系统显示的秋水仙碱DPP曲线图

（纵坐标以10^－8 A为单位的电流，横坐标为外加电位。）

在给定的实验条件下，微分脉冲极谱的峰电流与浓度成线性关系，以此可进行定量分析。脉冲极谱法对电极反应可逆的物质的检出限可达到10^－8 mol·L^－1，峰电位相差25～30mV仍能分辨，前放电物质比被测物质浓度大5×10⁴倍也不干扰测定。它对电极反应不可逆的物质也很灵敏，检出限也可达10^－6～10^－7 mol·L^－1。

本实验用微分脉冲极谱法测定秋水仙碱，以pH1.8的HAc－H₃PO₄－H₃BO₃缓冲体系（B.R缓冲液）中含0.6％浓度的（C₄H₉）₄NCl作底液，可以得到峰形较好的秋水仙碱DPP曲线（见图3－17），检出限在6.25×10^－7 mol·L^－1。

底液及其浓度对峰电流、检出限、工作曲线的线性，都有非常大的影响。选择（C₄H₉）₄NCl作为底液，秋水仙碱有较好的DPP峰。其浓度较高时基线噪声大，不宜选择。降低底液浓度，峰形趋佳。但过低的底液浓度，将使线性范围变窄。本实验选择0.6％（C₄H₉）₄NCl为底液。

pH值对测量有较大影响。在酸性环境下，随着pH值的升高，秋水仙碱的DPP峰电位更负，会受到上摆的基线末端干扰，但酸性过高会使得基线噪声增大，峰形变坏；在中性环境下则不出峰。实验选择pH值为1.8的B.R.缓冲溶液配制底液。

综上所述，从峰电流、检出限、线性范围等角度考虑，以pH值为1.8的B.R.缓冲溶液中0.6％浓度的（C₄H₉）₄NCl作为底液可以保证较大范围的线性程度，并能保证较高的峰电流和较小的基线噪声，是比较合适的底液浓度。

本实验的干扰物质的影响较少。浓度高达200倍的K₂SO₄、KCl、NaCl、Na₂SO₄、KNO₃均无干扰，浓度高达100倍的酒石酸钠、草酸、柠檬酸、抗坏血酸、茜素也无干扰。丁二酮肟和CuSO₄的浓度达到秋水仙碱浓度的20倍时有干扰，前者会消除峰形，后者使峰形改变。

三、仪器和试剂

1.仪器

CHI821电化学分析仪（带微分脉冲功能，上海辰华仪器公司）

滴汞电极（Bioanalytical Systems Inc.），Ag/AgCl电极，铂电极

高纯氮钢瓶

容量瓶　50mL 1个

吸量管　5mL 1支，10mL 1支

微量进样器

2.试剂

秋水仙碱标样（Fluka HPLC）

四丁基氯化铵［（C₄H₉）₄NCl，化学纯］

pH值为1.8的B.R.缓冲溶液

秋水仙碱药片（西双版纳制药厂，标示量0.5mg）

四、实验步骤

1.溶液的配制

1）秋水仙碱标准溶液的配制。准确称取0.0250g秋水仙碱标样，用去离子水溶解，定容于50mL的容量瓶中，配制成1.25×10^－3 mol·L^－1的标准溶液。

2）配制的底液。pH值为1.8的B.R.缓冲溶液中含0.6％浓度的（C₄H₉）₄NCl作为底液。

3）试样的制备。以5mL去离子水溶解秋水仙碱药片1片。

2.仪器的连接及条件设置

1）将滴汞电极、Ag/AgCl电极、铂电极与CHI821电化学分析仪后背相应的电极输出端连接（注意连线的标识）。再将滴汞电极的控制滴汞时间端与CHI821电化学分析仪的信号控制端相连，以控制滴汞的滴下时间。

2）在电解池中加入10mL底液，用微量进样器加入一定体积的秋水仙碱标准液，通氮4min。

3）实验条件设置。

①进入测定方法程序。打开CHI821电化学分析仪的操作软件，在“Thchnique”项下设置，选择“Differential Pulse Voltammetry”，并在下方“Polarographia”框内打勾，进入DPP方法。

②设置参数。在“Parameters”项下设置：起始电位（Init E）－0.6V，终止电位（Final E）－1，2V，脉冲振幅（Amplitude）0.05V，脉冲宽（Pulse Width）0.06s，脉冲间隔（Pulse Period）2s，静置时间（Quiet Time）2s，灵敏度（Sensitivity）1×e－6。

③设置完毕后，按运行键（Run）开始扫描，扫描停止后，按“Date Plot”键，显示扫描曲线。按“Manual Results”键可以显示扫描所得的峰位信息。见图3－17。

3.标准加入法测定药片中的秋水仙碱

在电解池中加入10mL底液及200μL试样，通入氮气4min，在上述设置条件下扫描，得到的DPP曲线。再在该测定溶液中，加入秋水仙碱标准液50μL，连续4次。每加入一次，记录DPP曲线。

五、数据处理

1）记录得到的秋水仙碱DPP曲线，测量峰电流。

2）以每次加入秋水仙碱标准液的DPP峰电流（Y轴）对加入量（X轴）作图，通过反向延长至X轴的值，按标准加入法计算药片中的秋水仙碱的含量。

六、注意事项

由于仪器的兼容性问题，滴汞电极的自带电极输出装置与CHI电化学分析仪的信号控制无法匹配。因此，把加电压信号、电流信号采集与控制汞滴滴下时间信号分别连接，方法是将CHI电化学分析仪的电极输出直接连在三电极的工作体系的3支电极上，再将滴汞电极的信号输出与CHI电化学分析仪的信号控制相连，以控制滴汞的滴下时间。

应注意滴汞电极的安全使用，用过的汞应回收到指定容器内，切不可随手到入水槽。

七、思考题

1.微分脉冲极谱法与经典直流极谱法的区别在哪里？

2.实验中控制合适的缓冲体系及底液，对测量的意义何在？

八、实验拓展

测定中药样品中的秋水仙碱的含量。

将中药样品（山慈菇、藜芦、萱草根、黄花菜）切成小段，各称取3.0g，准确量取去离子水30mL，浸泡2～3h。以pH1.8的B.R.缓冲溶液中0.6％浓度的（C₄H₉）₄NCl为底液，扫描DPP曲线。

参考文献

［1］汪乃兴，赵滨，陈建民等.植物生物分子的电分析化学研究（Ⅷ）———秋水仙碱的微分脉冲极谱行为及分析应用.应用化学，1992，9（1）：100～102

［2］冶保献，木合塔尔·吐尔洪，曲松.秋水仙碱的电化学性质及电分析方法研究.分析科学学报，2004，20（5）：458～460

［3］中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）.北京：化学工业出版社，1990，359

［4］于素华，胡效亚，冷宗周.碳糊电极阳极伏安法测定秋水仙碱.药学学报，1997，32（3）：210～212