实验9 双波长－三波长分光光度法测定复方盐酸苯丙醇胺片
一、目的
学习双波长及三波长分光光度法的测定原理，掌握用单波长分光光度计进行双波长及三波长分光光度法测定的方法。
二、内容提要
双波长或三波长分光光度法可以看成是普通分光光度法的一种计算方法。当吸收光谱相互重叠的两组分共存时，可以通过双波长或三波长分光光度法逐一求出两组分各自的含量。
双波长分光光度法进行定量测定的依据是，待测组分a溶液在波长λ1和λ2处的吸光度差值ΔAa与待测组分的浓度成正比。此时，共存的干扰组分b在这两个波长处具有相同的吸收，即ΔAb为零，从而消除它对待测组分的干扰，这即双波长分光光度的等吸收点方法。有定量关系式
式中ε为摩尔吸光系数，b为吸收光程，ca为待测组分的摩尔浓度，1、2角标为两个波长处的值。
如何选定波长λ1和λ2是本方法的关键。可通过作图的方法来确定，具体方法见图4－5。待测组分光谱a的吸收峰λ2处作波长轴的垂直线，交于干扰组分光谱b，由交点再作吸光度轴的垂直线，交于干扰组分光谱b的λ1处，待测组分光谱a的在λ1处的吸光度值及λ2处吸光度值的差即为ΔAa，对干扰组分光谱b，有ΔAb为零。
三波长分光光度法进行定量测定的依据是，以待测组分的吸收峰波长为λ2，测得吸光度A2，在吸收峰两边的波长λ1、λ3处测得A1、A3，并连接此两点，得到A2与该连线在λ2处吸光度的差值ΔA，此ΔA与待测组分的浓度成正比。
设b为待测组分，a为干扰组分，在波长λ1、λ2、λ3处测得b组分的吸光度Ab1、Ab2、Ab3，设λ2－λ1＝m，λ3－λ2＝n，令
式中εb为待测组分在相应测量波长下的摩尔吸光系数，cb为待测组分浓度，b为吸收光程，1、2、3角标为3个波长处的值。若在λ1、λ2、λ3处测得纯a干扰组分的吸光度为Aa1，Aa2、Aa3刚好在一直线上，则
那末在测定含有a组分的b组分时，测得的ΔA即与cb成正比。根据上述原理，可以在纯组分的吸收光谱上用作图法方便地找到λ1、λ2、λ3的最佳组合，使ΔAa值为零，ΔAb值最大。选择三波长的具体方法如图4－6所示。
图4-5 测定扑尔敏的双波长选择（pH＝1）
（吸收光谱曲线：a－扑尔敏16μg·mL－1，b－盐酸苯丙醇胺100μg·mL－1）
图4-6 测定盐酸苯丙醇胺的三波长选择（pH＝4.5）
（吸收光谱曲线：a－扑尔敏16μg·mL－1，b－盐酸苯丙醇胺100μg·mL－1）
待测组分光谱b的吸收峰λ2处作波长轴的垂直线，交于干扰组分光谱a，由交点再作一直线，交于干扰组分光谱a的λ1、λ3处，得到待测组分光谱b的在λ1、λ3处连线与λ2处垂直线的交点的吸光度值，它与待测组分光谱b的吸收峰λ2处吸光度值的差即为ΔAb，对干扰组分光谱a，有ΔAa为零。
复方盐酸苯丙醇胺片由盐酸苯丙醇胺、扑尔敏和辅料制成。一般采用非水滴定方法测定盐酸苯丙醇胺的含量。若用分光光度法直接测定盐酸苯丙醇胺，则药片中存在的扑尔敏会干扰测定。本实验采用双波长及三波长分光光度法，通过选择合适的测定波长组合，消除共存组分的干扰，用双波长方法测定复方片剂中的扑尔敏，用三波长方法测定盐酸苯丙醇胺。本法操作简便，不需经过分离即可直测定各组分含量，且线性关系良好，对药片中两种组分的测定回收率均大于99％。
三、仪器和试剂
1.仪器
TU－1901双光束紫外可见分光光度计或其他型号自动记录紫外分光光度计（一对石英液槽）
容量瓶 25mL 12个，250mL 3个
移液管 2mL 1支，10mL 1支
量筒，烧杯，漏斗等
2.试剂
盐酸苯丙醇胺对照品
扑尔敏对照品
辅料
复方盐酸苯丙醇胺片（配方为：每片含盐酸苯丙醇胺12.5mg，扑尔敏2mg）
四、实验步骤
1.确定组合波长
1）配制扑尔敏（16μg·mL－1、pH为1的硫酸体系）、盐酸苯丙醇胺（100μg·mL－1、pH为4.5）各自的水溶液。
2）在230～280nm波长范围内，以蒸馏水为参比，分别测绘扑尔敏、盐酸苯丙醇胺和辅料水溶液的吸收光谱。TU－1901紫外可见分光光度计的使用见附录。
3）用作图法确定测定扑尔敏时的双波长值，确定测定盐酸苯丙醇胺时的三波长值。
2.扑尔敏的测定
1）ΔA～c的工作曲线。以0.5mg·mL－1的扑尔敏对照品水溶液，分别配制成浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90及100μg·mL－1的标准溶液（硫酸体系，pH1），以蒸馏水为参比，在选定的双波长条件下分别测得ΔA值。
2）药片中扑尔敏含量的测定。取药片20片加水溶解，转入250mL容量瓶，定量稀释后过滤，取中段滤液6mL移至25mL容量瓶中，定量稀释（硫酸体系，pH1），按测定工作曲线的方法测定ΔA值。
3.盐酸苯丙醇胺的测定
1）ΔA～c的工作曲线。以1mg·mL－1的盐酸苯丙醇胺对照品的水溶液，分别配制成浓度为20、40、60、80、l00、120、140、160及180μg·mL－1的标准溶液（此时pH4.5），以蒸馏水为参比，在选定的三波长条件下分别测得ΔA值。
2）药片中盐酸苯丙醇胺含量的测定。取药片20片加水溶解，转入250mL容量瓶，定量稀释后过滤，取中段滤液2mL移至25mL容量瓶中，定量稀释（pH4.5），按测定工作曲线的方法测定ΔA值。
五、数据处理
1）由扑尔敏、盐酸苯丙醇胺水溶液的吸收光谱，用作图法确定测定扑尔敏时的双波长值。
2）由扑尔敏、盐酸苯丙醇胺水溶液的吸收光谱，用作图法确定测定盐酸苯丙醇胺时的三波长值。
3）绘制扑尔敏的ΔA～c的工作曲线，确定呈线性的浓度范围，拟合线性回归方程，并计算相关系数。求出每片药片中扑尔敏的含量。
4）绘制盐酸苯丙醇胺的ΔA～c的工作曲线，确定呈线性的浓度范围，拟合线性回归方程，并计算相关系数。求出每片药片中盐酸苯丙醇胺的含量。
六、思考题
1.溶液的pH如何控制？
2.辅料溶液应如何配制？测量其吸收光谱的目的何在？
3.为什么药片的试样液需要过滤？怎样过滤？
七、实验拓展
1）在不同酸度下，测定盐酸苯丙醇胺和扑尔敏溶液的吸收光谱，比较酸度对光谱的影响。
2）盐酸苯丙醇胺的测定方法的回收率试验。可按药片配方比例配制模拟试样，在选定的三波长，按样品测定方法，测定模拟试样中盐酸苯丙醇胺的ΔA，根据盐酸苯丙醇胺的已知加入量和测得量计算回收率（测得量/加入量）。同样，可对扑尔敏测定方法进行回收率试验。
3）用高碘酸钠定量将苯丙醇胺氧化成苯甲醛，然后用普通分光光度法在242nm处测定苯甲醛含量，再推算盐酸苯丙醇胺的含量。
4）试用双波长等吸收点法测定盐酸苯丙醇胺片中盐酸苯丙醇胺的含量。
八、附录
TU－1901双光束紫外可见分光光度计
（1）简介
TU－1901双光束紫外可见分光光度计（以下简称光度计）由北京普析通用仪器有限责任公司生产，它由主机、计算机及打印机组成，见图4－7。其测光系统为双光束，动态反馈直接比例记录。仪器由软件UV Win在Windows环境控制下运行，软件有光度测量、光谱测量、定量测定及时间扫描等功能。
图4-7 TU－1901双光束紫外可见分光光度计
仪器的波长范围190～900nm，起始和终止波长按1nm为单位设定，定位命令可按波长重复精度0.1nm为单位设定，波长显示为0.01nm，内置波长自动校正功能为±0.03nm。光谱带宽分为0.1、0.2、0.5、1、2、5、6nm档，分辨率为0.1nm，测光重复精度ΔT为±0.001，在220nm处的杂散光≤0.0002。软件UV Win的界面从上到下提供主菜单、快捷操作按钮的工具条、显示条（上部），中间为工作窗口，工作窗口左侧提供了命令条的快捷操作按钮，下部为提示条。
（2）仪器的使用
1）开机自检。开启计算机电源，进入Windows操作环境。确认样品室无挡光物，打开主机电源。点击“开始”，选择“程序→紫外窗口→TU－1901UWin”，进入紫外控制程序，出现初始化工作界面，计算机将对仪器自检，并初始化。（过程要4min，每项测试后，相应项显示OK）。继续预热15～30min。
2）光谱的扫描。
①进入光谱扫描。选择菜单“应用→光谱测量”，或按工具条快捷操作按钮，打开光谱扫描窗口，上部有10个通道钮。
②设定扫描参数。选择菜单“配置→参数”，或按“F6”键，或按工具条快捷操作按钮。按窗口显示引导设定参数，注意起始和终止波长必须为整数。
③空白样进行基线校正，以消除液槽的误差。单击命令条“Base line”。扫描完后存盘。
④扫描。插入样品后，单击命令条“Start”，扫描按设定参数进行。扫描结果显示在屏幕上，最后10次扫描存入内存的10个通道上。按“Esc”键可中途停止运行。
3）对光谱进行处理。
①数学计算。选择菜单“数据处理→数学运算”，显示计算界面。可进行两条光谱间，或光谱与数值间的加、减、乘、除运算。
②图数转换。选择菜单“数据处理→变换”，显示变换界面。可对原通道光谱进行平滑、1～4次微分、对数、倒数、吸收光谱A～λ和透射光谱T～λ互换等转换，并存入新的通道。
③峰值检出。选择菜单“数据处理→峰值检出”，界面显示出当前通道的峰、谷值（数目在30个以内）。通过界面显示的“打印”按钮，输出图谱或数据。通过界面显示的“通道”按钮，改变检出的通道图谱。
④图谱显示的缩放及数据读取。选择菜单“视图→图谱缩放”，通过改变坐标起始与结束值，改变图谱的显示。选择菜单“视图→窗口缩放”，可把选定矩形框内的谱图放大到整个显示屏。选择菜单“视图→读屏幕”，可将十字光标位置，在显示条中显示该点的波长和吸光度值。选择菜单“视图→读图谱”，可将垂直线与光谱交点处的波长和吸光度值显示。
4）光度测量。
①进入光度测量。选择菜单“应用→光度测量”，打开光度测量子窗口。
②设定参数。选择菜单“配置→参数”，或按“F6”键，或按工具条快捷操作按钮。显示设定参数对话框。
③测定。先单击命令条“Auto zero”，进行空白校正。再单击“Read”按钮，测定试样。同时系统按设定的计算表达式进行计算。
5）定量测定。
①进入定量测定。选择菜单“应用→定量测量”，打开定量测量子窗口。
②设定操作参数和条件。选择菜单“配置→参数选择”，或按“F6”键，或按工具条快捷操作按钮。测量模式可选单波长、双波长、三波长或1～4次微分法。按界面引导输入相关参数。再单击屏幕右下方的参考按钮，进入参考对话框，选择标准曲线拟合公式形式、拟合次数、浓度单位等，并输入标准溶液的参考样品数及浓度值。
③标准样测定。单击命令条“Start”，显示测定窗口，再单击“Read”按钮，插入待测标准样的输入编号，单击确认钮后，即可测量，并显示测量值。
④标准曲线的显示。选择菜单“数据处理→工作曲线”，显示对话框。可修改曲线显示的纵横坐标、查看拟合效果、打印出标准曲线和标准样的数据。
⑤测定。在定量测定窗口活动时，按“F8”键，或按命令条“Read”按钮。可设定波长，根据标准曲线计算溶度，并保存。
参考文献
［1］厦门大学化学系分析化学教研室.双波长分光光度法原理简介.分析化学，1978，6（3）：224～231
［2］过乃蓉，罗庆尧，陈震华，曾云鹗.三波长分光光度法的原理和应用.分析化学，1983，11（6）：408～413
［3］詹芝蓉.分光光度法测定复方盐酸苯丙醇胺片含量.医药工业，1986，17（1）：10～11
［4］马林，徐华华，吴性良，谢萍，陆勤秀.双波长－三波长分光光度法测定复方盐酸苯丙醇胺片.化学世界.1991，32（5）：218～221
［5］北京普析通用仪器有限责任公司.TU－1901双光束紫外可见分光光度计使用说明书
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