酪氨酸和苯丙氨酸

实验15　同步荧光分析法同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸

一、目的

学习同步荧光分析法的基本原理。掌握用荧光分光光度计测量三维荧光光谱及同步荧光光谱的方法。

二、内容提要

当物质分子吸收紫外及可见区电磁辐射后，它的电子能级由基态跃迁至激发态，又很快地以电磁辐射形式将这部分能量释放出来，回到基态，我们称它为光致发光。最常见的两种光致发光现象为荧光和磷光。

光致发光涉及吸收辐射和光的发射两个过程，因此，它具有较大的信息量。对于荧光过程，可以获得三维荧光光谱，它是在激发光波长与发射荧光波长同时变化时的荧光强度变化。也称为总发光光谱，或称激发－发射矩阵。它可用等角三维投影图或等高线光谱图两种方式表示。三维荧光光谱图可用正交多色器色散，二维多道检测荧光信号的荧光分光光度计绘制；也可在使用计算机联机系统的扫描荧光分光光度计上，进行操作控制、实时数据采集和运算，获得三维的荧光光谱图。

对于光谱互相重叠的不同荧光组分，在它们的三维的荧光光谱图上，可能会发现仍有不少区域不发生重叠。只要选择合适的起止波长和扫描速率，同时扫描激发单色器和荧光单色器波长，测绘荧光强度与相对应的激发光波长或荧光波长构成的光谱图，就可以避开组分间的光谱重叠干扰。以此为依据而建立的荧光分析方法称为同步荧光光谱法。按扫描方式不同可以分为以下3类。

1）固定波长同步扫描荧光测量。在同步扫描中使激发波长λ_ex和发射荧光波长λ_em保持固定的波长间隔，即λ_em－λ_ex＝Δλ为常数。

2）固定能量同步扫描荧光测量。用能量关系代替波长关系，在扫描时，保持两个单色器之间有固定的波数差。即［（1/λ_ex）－（1/λ_em）］×10⁷＝为常数。

3）可变角（或可变波长差）同步扫描荧光测量。扫描中两个单色器的扫描速率并不维持某一特定比率，而是满足某一函数关系。

这样测得的荧光强度仍然和荧光物质浓度成线性关系，并以此进行定量。同步荧光光谱简化了光谱图，谱带窄化，减少了光谱重叠现象及散射光的影响，提高了分析的选择性。

在固定波长同步荧光分析法中，Δλ的选择合适与否直接影响到重叠光谱的分离效果和方法的灵敏度等。对单一组分，当Δλ等于斯托克斯位移时，可得到强度最强、半峰宽最小的单峰同步荧光光谱。对混合组分，Δλ的选取需要综合考虑各组分同步荧光信号的强度及分离效果等因素，最终由实验来选择和确证。

天然氨基酸中仅有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸会发射荧光，它们的激发光谱和发射光谱互相重叠，不能实现混合样中三组分分别测定。早期多采用预分离或化学处理后分别测定的方法。本实验采用固定波长同步扫描的荧光测量技术，同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸混合物中各自的含量。

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在中性水溶液中可获得同步荧光光谱，它们的特征峰依次为284nm、232nm、217nm（均指激发波长）。酪氨酸和苯丙氨酸可直接用特征峰的峰高定量，色氨酸的284nm特征峰受酪氨酸的特征峰拖尾影响，定量时应将影响扣除，具体方法为

式中F为校正后色氨酸的284nm特征峰的荧光强度，F₂₈₄为同步荧光光谱上测得色氨酸的284nm处的荧光强度，F₂₃₂为同步荧光光谱上测得酪氨酸的232nm处的荧光强度，K_284/232为单组分酪氨酸的同步荧光光谱上测得284nm处荧光强度与232nm处荧光强度的比值，F₀为空白溶液在284nm处的信号强度。

据文献报道，按上述方法测定时的浓度范围，色氨酸为0.001～0.5μg·mL^－1，酪氨酸为0.02～1μg·mL^－1，苯丙氨酸为0.07～5μg·mL^－1。

三、仪器和试剂

1.仪器

F－4500荧光分光光度计或Cary Eclipse荧光分光光度计（附石英液槽）

吸量管　1mL 3支，2mL 3支，5mL 1支

容量瓶　25mL 12个，50mL 3个

烧杯　50mL 3个，100mL 1个

2.试剂

色氨酸标准储备溶液　0.625mg·mL^－1：用L－色氨酸配制成水溶液

酪氨酸标准储备溶液　0.625mg·mL^－1：用L－酪氨酸配制成水溶液

苯丙氨酸标准储备溶液　1.25mg·mL^－1：用L－苯丙氨酸配制成水溶液

缓冲溶液　pH7.4：用0.5mol·L^－1 NaOH和0.5mol·L^－1 KH₂PO₄溶液，以（4∶5）体积比混合

四、实验步骤

1.标准溶液的配制

（1）配制标准溶液A

1）色氨酸标准溶液A　6.25×10^－6 g·mL^－1：取0.50mL 0.625mg·mL^－1的色氨酸标准储备溶液，用pH 7.4的缓冲溶液稀释到50mL。

2）酪氨酸标准溶液A　12.5×10^－6 g·mL^－1：取1.00mL 0.625mg·mL^－1的酪氨酸标准储备溶液，用pH 7.4的缓冲溶液稀释到50mL。

3）苯丙氨酸标准溶液A　25.0×10^－6 g·mL^－1：取1.00mL 1.25mg·mL^－1的苯丙氨酸标准储备溶液，用pH 7.4的缓冲溶液稀释到50mL。

（2）配制标准溶液B

1）色氨酸标准溶液B　0.250×10^－6 g·mL^－1：取1.00mL色氨酸标准溶液A，用pH 7.4的缓冲溶液稀释到25mL。

2）酪氨酸标准溶液B　0.500×10^－6 g·mL^－1：取1.00mL酪氨酸标准溶液A，用pH 7.4的缓冲溶液稀释到25mL。

3）苯丙氨酸标准溶液B　1.00×10^－6 g·mL^－1：取1.00mL苯丙氨酸标准溶液A，用pH 7.4的缓冲溶液稀释到25mL。

4）混合溶液：取色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸标准溶液A各1.00mL，用pH7.4的缓冲溶液稀释到25mL。

2.绘制三维等高线荧光光谱图及固定波长同步扫描荧光光谱图

1）实验条件：单色器通带为5nm，激发光波长范围为200～360nm，激发波长扫描间隔为5nm，荧光发射波长范围为240～400nm，荧光发射波长扫描间隔为2nm，扫描速度为240nm·min^－1。

2）对混合溶液绘制三维等高线荧光光谱图。按实验14附录中绘制三维荧光光谱图的操作进行。

3）根据混合溶液的三维荧光光谱图确定固定波长同步扫描荧光测量中的波长间隔Δλ、扫描的起止波长。

4）按2、3）中确定的Δλ值和扫描的起止波长，对色氨酸标准溶液B、酪氨酸标准溶液B及苯丙氨酸标准溶液B绘制固定波长同步扫描荧光光谱图（见实验14附录，按绘制同步扫描荧光光谱图的操作进行）。同时测量3种溶液相应的激发光谱和荧光光谱，进行比较。

3.标准曲线法的测量

1）在3种氨基酸的测定浓度范围内，用pH 7.4的缓冲溶液配制不同浓度的混合液（每种氨基酸均应有5种浓度），例如：取色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸标准溶液A各1.50、1.00、0.50、0.25及0.10mL混合于5个25mL容量瓶中，用pH 7.4的缓冲溶液稀释至刻度。取未知混合液5mL，用pH 7.4的缓冲溶液稀释到25mL。

2）对所配的标准混合溶液、未知混合溶液和空白溶液，按实验步骤2、3）中确定的Δλ值和扫描的起止波长绘制同步荧光光谱图。

4.标准加入法的测量

1）取未知混合液两份各5mL，其中一份用pH 7.4的缓冲溶液稀释到25mL。另一份加入色氨酸标准溶液A，酪氨酸标准溶液A，苯丙氨酸标准溶液A各0.50mL，用pH 7.4的缓冲溶液稀释到25mL。

2）对未知混合液、加标未知混合液及空白溶液作同步荧光光谱图的测量。按2、3）中确定的Δλ值和扫描的起止波长，绘制固定波长同步扫描荧光光谱图。

五、数据处理

1）记录混合溶液的三维等高线荧光光谱图。确定固定波长同步扫描荧光测量的波长间隔Δλ及起止波长。

2）记录色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的激发光谱、荧光光谱和固定波长同步扫描荧光光谱图。确定各组分的同步荧光光谱图的峰值波长，及在组分酪氨酸的同步荧光光谱上，色氨酸峰值波长处荧光强度与酪氨酸峰值波长处荧光强度的比值K。

3）根据实验步骤3中的数据分别绘制3种氨基酸各自的同步荧光信号强度对浓度的工作曲线。未知样中的酪氨酸、苯丙氨酸可直接从其各自的工作曲线上求得浓度，色氨酸需通过公式（4－17）进行校正处理，求得它在未知样中的含量。

4）记录标准加入法中未知混合液、加标未知混合液及空白溶液的同步荧光光谱图。读出各同步荧光光谱图上色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的峰值处的荧光强度。扣除空白，计算未知混合液中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量。

六、思考题

1.色氨酸的同步荧光峰受酪氨酸的同步荧光峰拖尾影响，你认为还可用什么方法消除影响？

2.比较色氨酸的同步荧光光谱和激发光谱、荧光光谱的异同，以此为例阐述同步荧光分析法的优缺点。

七、实验拓展

用同步荧光光谱法或其他方法测定市售氨基酸口服液、氨基酸注射液的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量。

参考文献

［1］许金钩，王尊本主编.荧光分析法（第三版）.北京：科学出版社，2006，137

［2］黄贤智，许金钩，李耀群.同步荧光法同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸.分析化学，1987，15 （3）：199～202