柱色谱法（甲基橙-靛酚的分离）

实验十一　柱色谱法（甲基橙-靛酚的分离）

一、实验目的

1．学习柱色谱法的原理。

2．掌握柱色谱法操作方法。

二、基本原理

色谱法是分离、提纯、鉴定有机化合物的重要方法之一，有着广泛的用途。色谱法的基本原理是利用混合物中各个成分的吸附或溶解性能（即分配）不同，或其他亲和力的差异，当选择某一条件，使各个成分经过吸附剂时，各成分进行反复的吸附或分配作用，从而将各组分分开。一般说来，化合物中官能团的极性强，它在固定相表面的吸附力也强。

常用的色谱法有柱色谱法、薄层色谱法、纸色谱法等。柱色谱法可看做是一种固-液吸附色谱法，它是通过色谱柱进行分离的，色谱柱一般是一根长约20cm，内径为2cm，下端有一个活塞，在柱子底部有一层玻璃砂芯的装置。管内装填活化的固体吸附剂（固定相）如氧化铝、硅胶等，在柱子顶部装一滴液漏斗，样品从柱顶加入，被吸附在柱的上端，然后从滴液漏斗加入洗涤剂（流动相）如乙醇、石油醚等。由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，被吸附较弱的组分随溶剂以较快的速度向下移动，各组分随溶剂以不同的时间从色谱柱下端流出，分别收集各组分，再逐个鉴定。若各组分是有色物质，则在柱上可以直接看到色带；若是无色物质，可用紫外光照射，有些物质呈现萤光。

三、仪器和试剂

1．仪器

色谱柱　　　　　　　60mL滴液漏斗

玻璃漏斗　　　　　　50mL烧杯

50mL三角烧瓶　　　　10mL量筒

2．试剂

层析氧化铝　　　　　甲基橙

靛酚　　　　　　　　95%乙醇

四、实验步骤

1．装柱

填装好层析柱是柱层析成功的关键，层析柱要填得平整，中间没有气泡和空隙。如图3-16所示，将已洗净、烘干的色谱柱固定在铁架上，柱身要和桌面垂直（这样可形成较平整的柱面），将溶剂（95%乙醇∶水=4∶1，体积之比）20mL装入管内，先装入少量的氧化铝（在柱内约1cm高度时），打开活塞，使溶剂流出的同时将14g氧化铝通过干燥的玻璃漏斗慢慢加入管中而渐渐下沉，边加边用带橡皮管的玻棒轻轻敲打柱身，以排除空气，使填装均匀而无裂缝，加完氧化铝后，继续让溶剂流出，直到液面在氧化铝的顶部达0.5～1cm高度时，关闭下端活塞。在氧化铝上面用圆形滤纸覆盖，以保持顶部平整，不受加入溶剂的干扰而产生不规则的色带。

图3-16　柱色谱装置

2．加样

将色谱柱中的溶液从下端放出，直到液面在氧化铝顶部约1mm高度时，立即沿柱壁加入2mL样品溶液，当样品液面在氧化铝顶部约1mm高度时，用少量溶剂（每次用量不能多，最好少量多次）洗下柱壁上的样品物质，重复2～3次，直到洗净为止（液体为无色）。

3．洗脱分离

在柱子顶端装上滴液漏斗，内盛20mL洗脱液（95%乙醇∶水=4∶1，体积之比），调节活塞开关使洗脱液逐滴放出，层析就开始进行，如图3-17所示。柱下用三角烧瓶收集，待第一部分（靛酚）蓝色即将流出时，取干净三角烧瓶收集洗脱液，到滴出液近无色为止，换一个接受器，改用pH=10的水溶液作洗脱剂，到黄色开始滴出时，再换一个接受器，到黄色物洗下为止。将收集物分别倒入指定的回收瓶中。

图3-17　色层展开

思考题

1．洗脱的流速过快或太慢时，对分离效果有什么影响？

2．为什么极性大的组分要用极性大的洗脱剂来洗脱？

附　注

1．将需要分离的混合物溶于尽量少的极性小的溶剂中，本实验用的混合样品是1mg靛酚和4mg甲基橙溶于3mL95%乙醇混合物。

2．吸附剂的用量与要分离的混合物的性质及数量有关。

3．层析柱必须干燥，否则水分增加，轻则层析速度减慢，重则不能分离。

4．在整个洗脱过程中，氧化铝柱上一直保持0.5～1cm高度的溶剂，注意液面不能低于氧化铝上的滤纸。