薄层色谱法（亚甲基蓝-荧光黄的分离）

实验十三　薄层色谱法（亚甲基蓝-荧光黄的分离）

一、实验目的

1．学习薄层色谱法的原理。

2．掌握薄层色谱法的操作。

二、基本原理

薄层色谱法也叫薄层层析法。它的特点是把吸附剂均匀地涂在一块玻璃板上，形成薄薄的一层，一般以0.5～1mm厚为宜。然后在这薄层上点好样品，将点了样品的薄板放在盛有一定展开剂的层析缸中，层析就在这薄层上进行，故称为薄层层析法。

层析法是一种有效的分离方法，它是将待分离的混合样品置于某种吸附剂（固定相）上，然后让一溶剂（流动相）通过。由于混合样品中各组分在吸附剂和溶剂中的吸附、溶解能力不同即在两相中的分配不同，所以各组分在固定相上随溶剂移动的速度不同，从而达到分离的目的。薄层层析法具有操作简便、灵敏度高等优点，因此广泛应用于物质的鉴定、分离和提纯。

有色物质的样品，在薄板上展开后可直接观察到它们的分离情况。但无色物质的样品，在薄层上展开以后，需要通过显色才能观察到它们的分离情况。显色方法可在薄板上喷显色剂或把薄板放入密闭缸中用显色剂熏蒸，从而显出有色斑点。对一些荧光物质样品，可在紫外光照射下来观察分离情况。

三、仪器和试剂

1．仪器

载玻片　　　　　10mL量筒

50mL烧杯　　　　250mL烧杯

表面皿　　　　　研钵

2．试剂

硅胶G（200～400目）

0.5%CMC水溶液（羧甲基纤维素钠水溶液）

0.1%亚甲基蓝水溶液

0.1 %荧光黄乙醇溶液

未知液

四、实验步骤

1．薄板的制备

称取3g硅胶G，加0.5%CMC水溶液7mL，立即调成糊状。用拇指和食指拿玻片一端的边缘，稍倾斜，将调好的糊状硅胶G倒在两块载玻片上，须让其斜面充满玻片表面，然后将手指轻轻振摇，目的是使表面均匀光滑，平置于桌上晾干后，放置烘箱内活化（105℃～110℃）30分钟，取出后放入干燥器内保存使用。

2．点样

用刀刮去薄层板左右两边的硅胶（因有边缘溶剂效应），距薄板底边1cm处画上起始线，在起始线上用铅笔轻轻点两点，两点间的距离为1cm，在另一端距顶边0.5cm处画上前沿线，用毛细管（内径小于1mm）分别吸取标准液和未知液垂直地轻轻接触到薄层的起始线上，如图3-21所示。两点之间的距离为1cm，样品斑点的直径要控制在2～3mm，为此毛细管的末端要平整，如溶液太稀，一次点样不够，需在第一次点样干后，再点第二、第三次，每次都要点在同一位置上，点的次数依样品溶液浓度而定，一般为2～5次，若样品量太少时，有的成分不易显出，若量太多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。点样时，使毛细管液面刚好接触薄层即可，切勿点样过重而使薄层破坏。

图3-21　薄板的点样

3．展开

在层析缸（可用250mL烧杯）中加展开剂（95%乙醇∶水=1∶1，体积之比）约5mL（高度不能超过1cm），如图3-22所示。盖上玻盖（薄层色谱需要在密闭容器中进行），静置一段时间，使杯内溶剂蒸气达到饱和，然后将点好样品的薄层板斜放在层析缸内，起始线必须在展开剂液面之上。当展开剂上升到溶剂前沿线且各组分已明显分开时，取出薄板放平晾干。

图3-22　层析展开

4．求比移值Rf

在固定的条件下，不同的化合物在薄层上移动的距离不同。当吸附剂、溶剂、展开剂及温度等层析条件相同时，Rf值是一个特有的常数，可作为定性分析的依据。将纯样品和未知液样品的Rf值进行对照，鉴定未知液。

思考题

1．在一定操作条件下，为什么可利用Rf值来鉴定化合物？

2．在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？

3．展开剂的高度若超过了起始线，对薄层色谱有何影响？

4．荧光黄和亚甲基蓝哪个爬行的速度快？为什么？

附　注

1．在制取薄层板中最常用的固态吸附剂是硅胶（SiO₂·H₂O），常含有黏合剂（CaSO₄·H₂O），以保证硅胶能粘在玻璃表面上，含有黏合剂的称为硅胶H，含有荧光物质的称为硅胶GF₂₅₄（可在波长250nm紫外光下观察荧光），含黏合剂和荧光剂的称为硅胶GF₂₅₄，也可用氧化铝制板。

2．硅胶是缩水硅酸（SiO₂·H₂O），在加热脱水过程中形成多孔性的硅氧交链结构的物质（—Si—O—Si—），其表面含有硅醇（OH—Si—OH）基，它对极性化合物具有吸附能力，同时也能吸附多量的水分，而硅胶的含水量关系到它的活性，含水量大，活性低，因此要加热除去水分来提高它的吸附能力，这一过程称为薄板的活化。

3．薄层板制备的好环是薄层色谱法成败的关键，为此，薄层必须尽量均匀且厚度 （0.25～1mm）要一致，否则在展开时溶剂前沿不齐，色谱结果也不易重复。