海洋微生物的采样

海洋微生物范围较广，其采样介质范围涉及海水、底泥、海洋生物以及海洋生物制品等，不同采样介质的采样要求各有其特点。因此采集海洋微生物样品时，首先要确定采样的介质以及要采集的微生物种类，并据此确定采样用的器具及培养基。在采样过程中要严格控制外源性的微生物污染，取样的器具要进行无菌化处理，在操作过程中必须有“无菌操作”的概念，避免接触样品及无菌器具以外的物品。采的样品必须具有代表性，如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品必须经过振摇，以获得均匀稀释液。

1.水样的采集

海洋微生物所在的水体多种多样，从远洋到近岸，从外海到池塘都是微生物研究常见的地方。水样的采集要根据水体的类型选用适宜的采水器，采水用的瓶、袋应预先灭菌，准确放置在预定水层，严格控制停滞时间。

常用的采水器类型有：尼斯金采水器、采水瓶和击开式采水器。

（1）尼斯金采水器（Niskin sampler）。

尼斯金采水器是由尼斯金（Niskin S.）于1962年设计的，又称蝴蝶袋式（butterfly baggie）采水器。这种气囊式采水器包括一个由弹簧激活的金属支架和一个可拆卸、密封无菌的2L的一次性聚乙烯袋。接到指令后，传令器即激活一个刀片拆开密封的口部，然后释放扭杆弹簧打开气囊。这个动作产生一个吸力，可把海洋中任何深度的水样吸入采水袋。采样完成后，弹簧控制的机械装置将采水袋重新封口，防止采水器内外海水发生交换。有报道称这种采水器的问题在于塑料袋中可溶性有机物会发生渗漏，因此尽管样品是无菌采集的，但仍可能不符合某些生态学测试的要求。

（2）尼斯金采水瓶（Niskin bottle）。

目前，微生物海洋学上最常用的水样采集器是尼斯金采水瓶，是一种卡盖式采水器。靠水瓶内的橡皮带或涂特氟隆的弹簧来关闭采水瓶盖，用双重或三重旋转温度计架测温度。使用时，采水瓶开口进入海水中，到预定取样深度，连在盖上的绳子使瓶盖上的机械装置脱钩，瓶内橡皮带或弹簧便把瓶盖拉紧，将预定水层的水样牢牢封闭在尼斯金采水瓶中，然后将采水瓶提出水面完成取水任务。大多数现代海洋学研究采样时都把很多采水瓶安装在一个直径为1～2m的环状支架上，形如玫瑰花，因此被称为玫瑰花型采水器。一般来说，把装载有10～24个采水瓶的支架从海面的调查船上由电控装置下放到海里，这个装置叫塔门（pylon）。用这种采样器采集水样，必须有一个电控采样缆绳和一个环境感应器，这种环境感应器又称传导—温度—深度（conductivity-temperature-depth，CTD）装置，来提供海水深度和其他生境特征的实时信息，如光线、光的吸收和散射、荧光和溶解氧等。这些实时数据对于在特别感兴趣的区域（如荧光最大值、颗粒最大值和溶解氧最小值）中采水瓶的定位是非常有价值的。利用玫瑰花型采水器，可在同一深度采多个样，以满足统计学分析和大量样品的需要。采样缆绳和玫瑰花型采水器的PVC采水瓶都可用1mol/L的盐酸彻底清洗，然后用蒸馏水冲洗干净。对于大量样品（＞5L）的采集，使用玫瑰花型采水器一般很难做到真正的无菌采集。目前使用的尼斯金采水瓶的材质基本是聚乙烯，其容量可高达30dm3。

（3）击开式采水器。

击开式采水器是根据佐贝尔采水器改制而成的，适用于在500m以内的水层中采样。该采水器由机架和采水瓶两部分组成。采水瓶为500mL的注射用盐水瓶，瓶口由一个带有进水管的橡皮塞封闭（在深水采样时，为了防止橡皮塞被压入瓶内，可在瓶内安放一根适当长度的玻璃棒来支撑橡皮塞）。进水管由一根弯曲成直角形的玻璃管（内径6～7mm）、一段长260mm的厚壁橡皮管与一段长160mm的进水管三部分连接而成。直角形玻璃管的一端从橡皮塞中央插入盐水瓶内与盐水瓶相通，另一端与厚壁橡皮管连接。进水玻璃管的一端与厚壁橡皮管连接，其自由端则事先用酒精喷灯拉细，并在端部塞入少量棉花，整根进水管安装在盐水瓶上即成采水瓶。将采水瓶用纸包好，经121℃高压蒸汽灭菌20min，取出并立即用酒精喷灯把进水玻璃管上事先拉细的部分烧融密封。这样整个采水瓶内可以保持无菌的半真空状态，有利于水样进入瓶内。机架部分由一块黄铜板制成，呈梯形，共两翼呈72°角张开，高为290mm，宽为210mm，厚约6mm。采水瓶被安装在可以上下调节的半圆形孔板上，并由半环形铜带加以固定。进水管的橡皮部分卡在机架右上角下侧的半圆形缺口内，进水管玻璃部分则横放在机架左右两翼上角的两个缺口内，并被敲击杠杆和弹簧夹所固定。整个采水器用两个固定夹固定在钢丝绳上。在分层采水时，要在上一个采水器的弹簧连接杠下部的挂钩上挂一个使锤。

将挂有采水器的钢丝绳放入水中后，下放到预定的深度，投放使锤，敲打在敲击杠杆的后部，使其前端向上击起，折断进水玻璃管。由于瓶内是半真空状态，会产生负压而使海水进入采水瓶内。与此同时，弹簧连接杆受到敲击杠杆后部的压力而下降，致使其下端挂钩上的使锤脱落，沿着钢丝绳下滑，打击第二个采水器的敲击杠杆，折断第二个采水瓶的进水玻璃管，使第二个采水瓶进水，如此连续进行，使钢丝上采水器全部采到预定水层的水样。采集的水样要在2h内处理完毕，或者在4℃的条件下24h内处理完毕。

2.泥样的采集

目前还很少有专用的微生物采泥器，在采集泥样时，多借用底栖生物的采泥器，常用的采泥器主要有箱式采泥器、多管采泥器和弹簧采泥器。泥样中含有的微生物数量比上层海水中多得多，而且还包括底泥上面水层中所含有的全部微生物种类。至于采泥器本身所带的微生物则在采集器下沉到海底的过程中已经受到充分的冲刷，因此采泥器在使用前一般不必进行灭菌处理。采集海底沉积的样品，可以使用大洋型采泥器、小型底栖生物柱状采样管或地质取样管。海洋沉积物中微生物的取样层次，大面调查取表层；断面调查时，将岩芯管以3cm间隔分层取样；对于特殊的样品要求，可根据实际需要确定采样层次。

当采泥器提到甲板之后，用无菌器具从预定层次中取10～20g样品，置于无菌容器中。样品处理时称取约2g泥样，精确称重后，置于装有含吐温－80（10cm3/dm3）的18cm3海水并加玻璃珠的无菌三角瓶中，充分摇荡，制成悬浮液随即进行后续的微生物调查研究。剩余的泥样要烘干称重，以换算得到处理的泥样的干重。

3.生物样品的采集

海洋生物上通常携带了大量的微生物，它们之间呈共生、共栖或是寄生的关系，有些微生物可以帮助海洋生物更好地生存，有些微生物则可导致海洋生物的死亡。采集的海洋生物样品要有特征性，即具有携带目的微生物的典型表征，如研究致病微生物需采集有典型病症、濒死的生物个体，研究共生发光菌需采集发光强度较高的个体等。

海洋生物样品采集后根据规格和要求一般分为整体采样和组织采样两种。整体采样针对个体小、不能进行解剖取样或是解剖取样极易污染的生物样品，样品采集后需用无菌海水多次洗涤以尽量去除外源微生物污染，并进行整体匀浆以备后续培养分析。组织采样是对个体较大，可以进行解剖取部分组织进行定点分析的生物样品，样品采集后需用75%的酒精体表消毒，用无菌的解剖工具进行剖检并暴露特定的组织器官，直接采用平板划线法接种或是取部分组织样品于无菌容器内以备后续培养分析。

4.水产食品样品的采取和送检

在食品的检验中，样品的采集是极为重要的一个步骤。所采集的样品必须具有代表性，这就要求检验人员不但要掌握正确的采样方法，而且要了解食品加工的批号、原料的来源、加工方法、保藏条件、运输和销售的流程等各个环节。如果取样没有代表性或对样品的处理不及时、不得当，得出的检验结果可能毫无意义。如果根据一小份样品的检验结果去说明一大批食品的质量或一起食物中毒的性质，那么设计一种科学的取样方案及采取正确的样品制备方法是必不可少的。

（1）样品的采取和送检。

赴现场采取水产食品样品时，应按检验目的和水产食品的种类确定采样量。除个别大型鱼类和海兽只能割取其局部作为样品外，一般都采取完整的个体。待检验时再按要求在一定部位采取检样。在以判断质量鲜度为目的时，鱼类和体型较大的甲壳类虽然应以个体为一件样品单独采取，但当对一批水产品作质量判断时，仍需采取多个个体做检样以反映全面质量；一般小型鱼类和小虾、小蟹，因个体过小在检验时只能混合采取检样，在采样时需采数量更多的个体，一般可采500～1000g；鱼糜制品（如灌肠、鱼丸等）和熟制品采取250g，放灭菌容器内送检。

样品的采取必须遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。每取完一份样品，应更换新的取样用具或将用过的取样用具迅速消毒后，再取另一份样品，以免交叉污染。从取样至开始检验的全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。水产食品含水较多，体内酶的活性也较旺盛，易于变质。因此在采取好样品后应在3h内送检，在送检过程中一般都应加冰保藏。冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻，若不能及时检验，应放于－15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于6 ℃～10℃冰箱保存，在24h内检验。

（2）检样的处理。

① 鱼类。

采取检样的部位为背肌。先用流水将鱼体体表冲净，去鳞，再用75%酒精棉球擦净鱼背，待干后用灭菌刀在鱼背部沿脊椎切开5cm，再沿垂直于脊椎的方向切开两端，使两块背肌分别向两侧翻开，然后用灭菌剪子剪取25g鱼肉，放入灭菌乳钵内，用灭菌剪子剪碎，加灭菌海砂或玻璃砂研磨（有条件情况下可用均质器），检样磨碎后加入225mL灭菌生理盐水，混匀成稀释液。

剪取肉样时，勿触破及粘上鱼皮。鱼糜制品和熟制品应放乳钵内进一步捣碎后，再加生理盐水混匀成稀释液。

② 虾类。

采取检样的部位为腹部内的肌肉。将虾体在流水下冲净，摘去头胸部，用灭菌剪子剪除腹部与头胸部连接处的肌肉，然后挤出腹节内的肌肉，称取25g放入灭菌乳钵内。之后操作同鱼类检样处理。

③ 蟹类。

采取检样的部位为头胸部肌肉。将蟹体在流水下冲净，剥去壳盖和腹脐，去除鳃条，再置于流水下冲净。用75%酒精棉球擦拭前后外壁，置于灭菌搪瓷盘上待干。然后用灭菌剪子剪开，成左右两片，用双手将一片蟹体的头胸部肌肉挤出（用手指从足根一端向剪开的一端挤压），称取25g，置灭菌乳钵内。之后操作同鱼类检样处理。

④ 贝壳类。

采样部位为贝壳内容物。先用流水刷洗贝壳，刷净后放在铺有灭菌毛巾的清洁搪瓷盘或工作台上，采样者将双手洗净并用75%酒精棉球涂擦消毒后，用灭菌小钝刀从贝壳的张口处隙缝中徐徐切入，撬开壳盖，再用灭菌镊子取出整个内容物，称取25g置灭菌乳钵内。之后操作同鱼类检样处理。

水产食品兼受海洋细菌和陆生细菌的污染，检验时细菌培养温度一般为30℃。以上检样处理的方法和检验部位均以检验水产食品肌肉内细菌含量而判断其鲜度质量为目的。如需检验水产食品是否受某种病原菌污染时，其检样部位可能包括胃肠消化道和鳃等呼吸器官：鱼类检样取肠管和鳃；虾类检样取头胸节内的内脏和腹节外缘处的肠管；蟹类检样取胃和鳃条：贝类中的螺类检样取腹足肌肉以下的部分，贝类中的双壳类检样取覆盖在斧足肌肉外层的内脏和瓣鳃。

5.样品的贮存

水样和泥样经过贮存，首先发生的是细菌数目稍微减少，接着而来的是数目大量增加和种类不断减少。这种变化几乎都是在样品采集后1～2h最为显著，而且变化可能持续好几天。变化的大小是由下列因子来决定的：检样的原始成分、温度、检样大小、氧的有效供应、阳光的暴露及其他因子。大多数微生物学研究者认为，如果将海水及海泥样品贮存在低温处，就能减少其中的微生物种类与数量的变化，但是甚至在0℃也不能避免其中的变化。因此，多数研究者强调立即分析水样的重要性。研究表明，在0 ℃～7℃将水样贮存24h，水样中活细菌数目没有多大变动，但是它们的种类却大为改变。由于在野外分析海洋检样的困难，所以在文献中经常见到的许多研究报告都是来自检样经过几天或几周的贮存所得的结果。如果是在这种情况下，检验结果必须注明贮存的时间与温度。贮存温度最好在0℃左右。

底泥检样中无论是量的变化还是变化的速度都没有海水检样中那么大。这也许是因为环境因子对贮存的底泥菌数的影响，不像对贮存的海水检样的菌数影响那么大。