海洋微生物的培养和分离纯化

培养海洋微生物的方法有许多，可采用不同的培养基，但尚未有一种方法能够适用于所有海洋微生物的培养。海洋异养微生物分离常用培养基为2216E海洋琼脂培养基。在实际培养中，往往要根据所需微生物的生理生化特性，给予合适的营养物质、培养温度和通气条件。对于海洋微生物培养所需的特殊条件，如NaCl含量、压力条件等必须予以考虑。

2216E 海洋琼脂（ZoBell 2216Emarine agar）

蛋白胨　　　　　　　5.0g；

酵母膏　　　　　　　1.0g；

FePO4　　　　　　　0.01g；

琼脂　　　　　　　15.0～20.0g；

陈海水　　　　　　　1000cm3；

pH　　　　　　　7.4～7.8。

需要注意的是，由于天然海水中存在多种杀菌因素，在配制培养基之前，应将采集的天然海水在室内静置存放2周以上，使海水中的杀菌因素逐渐消除，固体颗粒性物质沉降后，再取上层海水使用。

选择合适的培养基接种后，针对不同微生物种类的培养条件也有差异。生长在深海或寒冷地区的嗜冷菌，培养时需要低温，而分布在温热带海区的嗜温菌，培养的适宜温度一般在25℃～30℃。不同菌种所需的培养时间也有较大的差别，常见的弧菌及大肠杆菌等在适宜温度下培养1～2d即可长出明显的菌落，而有些嗜冷菌则往往需要培养几周才能出现肉眼可辨的菌落。

关于一个微生物物种的生理学和生物地球化学活性机理方面的数据不容易直接从自然界中获得，只有严格控制实验室条件，才能仔细、系统地检测出环境变化对微生物生长和行为的影响，因此将微生物从自然环境中分离出来并建立纯培养，是研究其形态特征、生理特性、生态特性及基因测序基础。自从Zobell（1941，1946）开拓性地开展了海洋细菌的培养工作以来，随着对海洋微生物的生理特性和生态要求认识的不断深入，海洋微生物的培养技术有了很大的改进，越来越多的微生物被分离出来，获得了纯培养。虽然有许多方法可用来培养海洋环境中的微生物，但没有任何一种单独的方法能够适用于所有的微生物种类。一种方法只能培养全部海洋微生物群落中的一小部分，应用多种培养技术才能得出有意义的数据。

针对海洋中难培养的微生物，近年来，研究者发明了许多新型培养方法，能分离到许多新菌种的方法大都是通过模拟自然条件的生存环境，对环境中的微生物进行富集培养，再转移至普通平板进行分离纯化。虽然这种方法能提高分离得到难培养细菌的概率，但是还有许多难培养的细菌可能要依靠同一环境中其他菌株的存在才能生长，这些因为要有辅助菌株的存在才能形成菌落的细菌大多未能单独分离纯化得到。目前，即使在国外，许多研究似乎只是停留在对分离得到的细菌进行鉴定和分类的层面上，并未对难培养、未培养细菌的可培养机理进行深入研究。因此，对于分离得到的难培养、未培养细菌，深入关注其培养成活的原因是一个有困难但却极具意义的课题。是培养基的成分、培养温度、培养时间、氧气要求、pH要求等常见问题，还是受环境中其他细菌分泌的某种糖类、肽类等影响因子的控制等细节问题，这些都需要进行深入研究。

1.极限稀释培养

1993年Button 等首先利用稀释培养法（dilution culture）从海洋环境中分离得到两种新的寡营养异氧菌Sphingomonas alaskensis 和Cycloclasticus oligotrophus。稀释培养法是从概率论的角度出发而提出的一个新方法，即利用环境样品不断稀释浓度，当把样品中微生物群体总数稀释至一定浓度时，主要存在的寡营养微生物可以不受少数优势微生物的抑制、竞争作用等的干扰，因而大大提高主体寡营养微生物被培养的可能性。利用这种方法，舒特等也从海洋水体中分离得到典型的海洋细菌Sphingomonas alaskensis（菌株RB2256）。

2.高通量筛选技术

应用高通量分离培养技术有望培养出许多以前未被培养出来的微生物种类，事实证明海水样品中多达14%的微生物细胞可用高通量分离培养技术培养出来。高通量分离培养技术一般采用微孔板结合以流式细胞仪检测，这样可增加细胞检测的灵敏度，缩短低生长率细胞的培养时间。其中，美国Diversa公司建立的高通量分离培养技术是先制备包埋单个微生物细胞的琼脂糖微囊，然后将包埋在微囊中的微生物在缓慢流动的培养基中进行培养，培养结束后用流式细胞仪检测含有微菌落的微囊。在以上方法中，以美国Diversa公司建立的高通量分离培养技术最有发展前景。

3.微孔滤膜贴膜法

过滤的方法常常用于大量水样中含有较少细菌的样品的计数。过滤的机械作用会损伤或杀死一些细菌，不同品牌质量的滤膜也可能影响计数结果。此外，细菌个体小于滤孔的直径时，这部分细菌就不能留在滤膜上，造成计数结果偏低。目前计数海洋细菌时通常选用孔径为0.22μm的微孔滤膜。计数结果也受培养基和培养条件的影响。这种方法特别适合于计数含菌量极少的大洋水样。如果使用特殊的选择性培养基，还可以用来分离含量极少的特殊细菌，如分离海洋与河口样品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌等。

4.凝胶微滴培养法

凝胶微滴培养法也叫作单细胞封装培养法。最初是应用于海洋微生物的分离研究。该方法主要是利用凝胶微滴技术对环境中的单个细胞进行包埋，并结合流式细胞技术进行筛选分离的高通量培养方法。Zengler 等利用该方法，将稀释到一定浓度的菌液与融化的琼脂糖混合，制成包埋单个微生物细胞的琼脂糖微囊，然后将微囊装入凝胶柱内，用自然培养液进行流动培养。最后对所有培养分离得到的细菌进行16S rRNA序列分析，结果表明该方法能分离得到种类广泛的海洋细菌，如SAR11分支、Cytophaga分支、SAR116分支等，并且在分离得到的150株细菌中，只有71株细菌是分类于常见的细菌分支中，另外许多细菌则是之前未被培养出来的，也不存在于环境基因组库中。该方法允许被分离的细胞处于环境营养条件下进行生长，因此能分离得到许多有生存能力但不可培养的微生物。

5.模拟自然环境的扩散盒培养法

2002年，Kaeberlein 等通过模拟海洋微生物自然生长的环境，设计了一种名为扩散生长盒（diffusion growth chamber）的培养装置。该扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的孔径为0.03μm 的滤膜组成。具体操作是将被分离的环境样品放置于封闭的扩散盒中，并在模拟采样点环境条件的玻璃缸中进行培养。扩散盒滤膜的孔径大小可使盒内与盒外互相有益的小分子代谢物自由出入，但是细胞不能自由移动。Kaeberlein 等通过这种方法，分离到一株新的菌株，16S rDNA 序列比对亲缘关系最近的是Lewinella persica，序列相似性只有93%。该菌株不能在人工培养基上生长，而要在有其他菌株存在下即共培养的条件下才能形成菌落。