海洋微生物长期保存方法

菌种保存可以保持菌种的长期存活、特性稳定以及不受污染，对于微生物资源的保护、利用和研究开发，意义都非常巨大。菌种保存开始于19世纪末，最早开始菌种保存的是捷克斯洛伐克的微生物学家Frantisek Karl。他们利用玻璃管封闭的琼脂斜面、明胶或土豆的薄切片来保存菌种，并建立了世界上第一个菌种保存室。到目前为止，已建立发展了许多长期保存菌种的方法，其基本原则都是使细菌的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态，但又具有复苏的能力。一般是使细菌处于低温、干燥、缺氧和营养成分极度贫乏的环境条件下，将其新陈代谢限制在最低范围内，使其生命活动处于半永久性的休眠状态，使菌种能够存活、不污染杂菌、不发生或较少发生变异，保存菌种原有的生物学性状。

现有保存菌种的方法大体分为传代法、悬液法、普通干燥法、冷冻法、真空干燥法等。各种方法所应用的种类和效果各有差异，下面介绍保存海洋细菌的几种常用方法。

1.斜面或半固体传代保藏法

斜面传代法是最常用的暂时保存方法。把菌种接种到2216E斜面培养基上，在28℃条件下培养过夜，使之长成健壮的菌体。然后用封口膜封口后保存于15℃的环境中，以后每隔一定时间重新接种传代一次，就这样可以保持几周甚至数月。有些海洋细菌尤其是弧菌，在低于10℃、渗透压变化、寡营养（oligotrophic）（含碳源1～1.5mg/mL）等环境中，容易形成活的非可培养（viable but nonculturable，VBNC）状态，难以用常规培养法使其恢复生长。已证实常见的约20种弧菌均出现了VBNC状态，因此不宜将弧菌置于4℃的普通冰箱保存，以免出现“假死”现象。

在斜面或半固体穿刺培养基上，加封一层（2～3cm）无菌液体石蜡，防止培养基干燥并隔绝氧气，使菌种代谢降低。然后置于15℃培养箱中保存。这样一般每隔半年需移种传代一次。接种传代时，可直接用无菌接种环挑取斜面上的菌苔，然后在2216E平板上划线纯化，挑取典型单菌落接种斜面即可。

2.冷冻保存法

将培养好的接种斜面，用0.1%的蛋白胨水洗一下菌苔，制成菌悬液（菌浓度达109 CFU/mL），或直接用液体培养物，加冷冻保护剂如甘油、二甲亚砜、蔗糖和吐温-80等，至终浓度为15%（V/V），转移至2mL的塑料菌种保存管中。每个菌种一般保存3～5管，于冷冻后置于－80℃的超低温冷冻箱，可保存10年以上。也可将加有甘油或二甲基亚砜（DMSO）等保护剂的菌种管，经预冷冻（低于－60℃）后保存于液氮中（－186℃）。这样菌种可以保存30年以上，保存期间菌种不易变异，效果很好。该方法已经被世界上许多菌种保存机构如美国的ATCC等作为常规的菌种保存方法应用。在没用超低温条件的单位，也可以将菌种管保存于－20℃冷冻箱中，这样也可以保存一年以上。

注意在超低温保存过程中，一定要经过几级预冷冻（－20℃，20min；－40℃，20～30min；－60℃，20～30min）处理，最后再长期保存于超低温（－80℃）的条件下。在置于液氮保存时，最好预先置于－80℃冷冻箱一段时间，然后置于液氮罐液面以上气态部分进一步预冷却几分钟，再置于液氮中长期保存，这样可以避免细胞冻伤。菌种复苏时，可直接从超低温条件下取出菌种管，置于室温条件下解冻，然后取菌悬液涂布平板或平板划线，培养至长成单菌落。

3.真空冷冻干燥法

将培养好的菌种斜面，加入保护剂（如脱脂牛奶），制成菌悬液，装入特制的菌种冻干管中，迅速预冷冻至低于－70℃。然后置于真空干燥装置中冷冻干燥，至水分含量在1%～2%。火焰熔封管口，至4℃避光保存。该方法对陆生菌种保存效果较好，一般为数年至30年，但对海洋细菌的保存效果稍差。