海洋微生物多糖的分离纯化

多糖中羟基较多，极性大，通常用不同温度的水、稀碱溶液或稀酸溶液提取。粗提物中含杂质较多，主要为氨基酸、肽、蛋白质以及极性大的小分子和色素。肽和蛋白质通常用Sevage法、三氟或三氯乙烷法和三氯乙酸法除去，前两种方法多用于微生物多糖的提取，后一种方法多用于植物多糖的提取，3种方法均不适合糖肽，因为糖肽也会沉淀出来。多糖中的色素多为酚类化合物，通常在碱性条件下以过氧化氢氧化法脱色。小的极性分子则通过透析法除去。

粗多糖是相对分子质量极不均匀的混合物，需要进行分级和纯化。纯化的方法很多，常用的方法有分步沉淀法、金属离子络合法、离子交换层析法、凝胶过滤法等。

分步沉淀法包括有机溶剂分步沉淀法和盐析法。有机溶剂分步沉淀法是利用多糖在不同浓度的有机溶剂（常用醇或酮）中溶解度的差异，使不同相对分子质量的多糖沉淀出来。乙醇是应用最广泛的分步沉淀剂，简单方便，成本低。多糖在有机溶剂里溶解度小，在多糖的水溶液中加入乙醇破坏多糖溶剂化水膜，降低溶液介电常数，使多糖沉淀出来。加入低浓度的乙醇，相对分子质量大的多糖先沉淀出来，依次增加乙醇的浓度得到相对分子质量由大到小的多糖组分。因此乙醇沉淀法也用于多糖的分级。沉淀往往在pH 7左右进行，在此条件下多糖较稳定。盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同的性质，加入盐析剂使多糖逐步沉淀出来，常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，但硫酸铵最常用。

季铵盐沉淀法利用季铵盐与酸性多糖生成不溶于水的多糖化合物的特性，分离酸性多糖与中性多糖。常用的季铵盐有溴代十六烷基三甲胺（CTAB）和十六烷基盐酸吡啶（CPC）。多糖季铵盐复合物可溶于盐溶液或有机溶剂中，季铵盐可用透析法除去。多糖季铵盐复合物在不同盐溶液中溶解度不同，可以利用这一性质对多糖进行分级。若用此方法沉淀中性多糖，多糖应转化为负离子，才能与季铵盐生成沉淀，一般可使多糖形成硼酸盐复合物或在很高的pH（至少大于9）条件下进行沉淀。

离子交换层析法适用于分离携带电荷的多糖和低聚糖。如海洋硫酸酯多糖和多聚糖醛酸的分离，可利用该多糖中的羧基和硫酸基的取向、类型和数量的差异，用不同离子强度的氯化钠溶液洗脱，得到带不同电荷的多糖。另外通过柱层析，许多杂质被牢牢吸附于柱上端，从而达到纯化多糖的目的。凝胶过滤法又叫分子筛层析，此类层析的固相载体或介质是一些多孔性或网状结构物质，并且具有分子筛效应，当含有不同大小分子的混合物流经这一介质时，能将混合物中的各组分按分子大小进行分离，从而达到把分子大小不同的多糖分离开。凝胶过滤常用不同浓度的盐溶液洗脱，用硫酸 — 苯酚比色法或示差折射及紫外光谱法检验糖的浓度。