头孢菌素的发酵与合成

随着半合成头孢菌素的迅速发展，其基本原料头孢菌素C的工业生产越来越受到重视。从菌种选育、发酵培养条件的控制到高产优质提取方法的选择，都投入了较大的研究力量，不仅获得了高产菌株，而且探明了其生物合成途径，生产技术水平日益完善与提高，为发展各类半合成头孢菌素奠定了基础。

1.菌种

尽管在自然界中也发现了其他一些能产生头孢菌素C的微生物，但目前工业生产上用的菌种仍然是顶头孢霉菌。Brotzu发现的原始菌株—顶头孢霉菌49137（ATCC11550）生产能力很低，经过世界各国育种工作者不断努力，利用诱变或基因重组技术，获得头孢菌素C高产菌株，目前工业发酵已达到较高生产能力。

2.头孢菌素C的生物合成

已通过放射性标记化合物证实，头孢菌素C和青霉素相似，也是以L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸三种氨基酸作为前体，经三肽中间体LLD-ACV合成得到，目前确认的其生物合成途径如图5-13所示。首先由三肽中间体LLD-ACV生成异青霉素N，然后经差向异构酶转化为青霉素N，并通过扩环酶系生成去乙酰氧头孢菌素C（DOCPC），再羟化为去乙酰头孢菌素C（DCPC），最后在乙酰辅酶A的存在下，由乙酰基转移酶催化生成头孢菌素C。

图5-13　头孢菌素C的生物合成途径

研究表明，三肽中间体LLD-ACV的三肽至异青霉素N的环化，以及青霉素N去乙酰氧头孢菌素C的扩环是头孢菌素C生物合成中的两个关键阶段。发酵中产生的头孢菌素C会有一部分由酯酶降解，形成副产物去乙酰头孢菌素C（DCPC）。而酯酶的活性，会随培养液中碳源—甲油酸酯的耗尽而增加。维持培养液中甲油酸酯的浓度在0.005%或稍低一些，可减少发酵产物中去乙酰头孢菌素C（DCPC）的含量，从而提高头孢菌素C的含量。此外，在头孢菌素C的下游纯化工序中，若不分离回收这个副产物去乙酰头孢菌素C（DCPC），不仅会浪费资源，而且会造成环境污染。去乙酰头孢菌素C在C-3位的羟甲基使之能方便地用于某些半合成头孢菌素的合成，因此，回收发酵液中的去乙酰头孢菌素C，通过结构修饰使之成为某些头孢菌素药物的关键中间体具有重要意义。

3.菌丝形态的分化

顶头孢霉菌在发酵培养过程中主要有三种类型的细胞：菌丝、膨胀的菌丝碎片和节孢子。发酵初期的细胞形态主要为细长、放射形和表面光滑的长菌丝，随着时间的延长，一些菌丝分化、膨胀并断裂为不规则的膨胀菌丝碎片，再演变为球形或椭圆形的单细胞节孢子，当这种膨胀的菌丝碎片在培养液中占优势时，菌体开始大量合成头孢菌素C。

4.蛋氨酸的刺激作用

在顶头孢霉菌发酵的生长期中，蛋氨酸对头孢菌素C的合成表现出明显的促进作用。这种氨基酸虽然能够作为氮源或硫源，但并不是菌体生长所必需的。目前认为蛋氨酸是一种调节物，因而有促进作用，最近还认为它能诱导抗生素产生菌的细胞壁和细胞膜的通透性发生变化。但是，目前尚未确定蛋氨酸的最终作用机理。

5.发酵与代谢调控

头孢菌素C发酵是一个受代谢调控反应控制的、异常复杂的生物合成过程，如同其他抗生素一样，顶头孢霉菌在生产头孢菌素C的同时，往往也会产生一些副产物，例如，去乙酰头孢菌素C（DCPC）、去乙酰氧头孢菌素C（DOCPC）等结构相近的组分。在发酵过程中，若能从以下几方面进行调控，则可能使代谢朝着有利于头孢菌素C生物合成的方向转化，减少副产物，从而获得较高的目标产物产量：

（1）在菌丝生长阶段，供给充分的营养，并加入适量的蛋氨酸或硫脲等代谢调控剂、微量金属离子如Fe2＋、Mg2＋和必要的硫源，以促进“头孢菌素C合成酶系”的生成，并促使菌丝分化，形成较长的高度膨胀菌丝。

（2）在抗生素发酵过程中，常有糖降解产物的阻遏作用，头孢菌素C的合成也明显地发生葡萄糖阻遏现象。因此，在生长阶段向生产阶段转化时，应限制培养基内葡萄糖的浓度，使葡萄糖阻遏效应降至最低。在头孢菌素C生产阶段应维持一定的低碳源浓度，以延缓膨胀菌丝碎片的生长期，保持较长时间的“头孢菌素C合成酶系”活性，减少发酵液中去乙酰头孢菌素C（DCPC）含量。

（3）在发酵过程中保证足够的供氧，以维持头孢菌素C合成关键酶—扩环酶系的活性。据Feten等人报道，头孢菌素C发酵的临界氧分压和维持最大产物合成速率的氧分压分别为1066.6Pa和3066.4Pa。西班牙的Matin报道了将透明颤菌的血红蛋白（VHb）基因导入头孢菌素C工业生产菌—顶头孢霉中，用于改善菌体对氧的需求，降低生产成本，在相同条件下工程株的抗生素产量可高达对照株的250%。

（4）控制适当的碳、氮和磷浓度比例，防止或减少氮和磷对生物合成的负调控作用。