头孢菌素的提炼

头孢菌素C为氨基酸类化合物，通常以两性离子存在，水溶性很大，而且在发酵液中，除头孢菌素C外，常伴有青霉素N、去乙酰头孢菌素C（DCPC）、去乙酰氧头孢菌素C（DOCPC）等一些与头孢菌素C性质类似的代谢或降解产物，以及氨基酸与色素等杂质，这些都增加了从发酵液中分离与纯化头孢菌素C的难度。早年头孢菌素C的提取多使用经典的离子交换法、活性炭吸附法，后来又发展了溶媒萃取法、大孔吸附剂法及络盐沉淀法。为了得到较好的提炼效果，目前大多采用两种以上的方法交替使用。下面就上述四种主要方法在头孢菌素C提炼中的应用简述如下：

1.离子交换法

头孢菌素C分子具有两个羧基和一个氨基，由于氨基酸碱性较弱，不能用阳离子交换树脂吸附。在中性或酸性条件下，头孢菌素C呈现酸性。因此，可用阴离子交换树脂提取，用强碱性树脂，吸附虽好，但解吸附困难。所以一般采用弱碱性阴离子树脂提取头孢菌素C。

早期的离子交换法是先将头孢菌素C发酵液用草酸酸化至pH 4～5，沉淀蛋白质，然后加入醋酸钡以除去过量的草酸和干扰离子交换吸附效果的多价阴离子。过滤后的滤液，通过装有强酸H型阳离子树脂的交换柱酸化至pH 2.8～3，放置3～4h，以破坏其中的青霉素N，再用弱碱性阴离子交换树脂吸附，以醋酸吡啶或醋酸钠（钾）水溶液解吸，经减压浓缩、冷却，即可析出头孢菌素C钠（钾）盐结晶。收率自发酵液计算一般为40%～60%，常用的阳离子树脂有Amberlite IR-120等，弱碱性阴离子树脂有Amberlite IRA-68和Amberlite LR-4B等。

由于头孢菌素C钠（钾）盐水溶性大，结晶收率低，也可改用锌盐沉淀结晶，或在解吸液中，加入酰化剂，将头孢菌素C转化成N-酰化衍生物，再用溶媒提取法精制。

离子交换法提取头孢菌素C，存在选择性低、滤液中的杂质和无机盐严重影响交换容量等缺点，因此，虽经多次改进与提高，产品质量与收率仍不理想。但它具有操作简便，设备简单，节约有机溶媒的优点，所以现在仍可与其他提取方法交替使用。例如，先用大孔吸附剂法，再用离子交换法提取。

2.大孔吸附剂法

早期曾用活性炭吸附法提取头孢菌素C，用含水有机溶媒洗脱，此法一般收率与质量均较低。随着新型大孔吸附剂的发展，近年来为了改进头孢菌素C的分离与纯化，许多工厂多引用大孔树脂提取头孢菌素C。大孔吸附剂对头孢菌素C的吸附作用基于范德华力，根据吸附理论中的盐析作用原理，发酵液中存在无机离子和极性物质，不但不干扰吸附过程，反而促使非极性有机大分子更好地被吸附，这一点比阴离子交换树脂更可取，从而改善和提高了头孢菌素C的提取与纯化效果。常用的非离子型大孔树脂有Amberlite XAD-2、XAD-4、Diaion HP-20和SKC-02等。由于有些杂质与色素不易分离，所以大孔吸附法分离后一般需再经弱碱性阴离子树脂进一步纯化。例如，将头孢菌素C发酵液用硫酸酸化至pH 2.5～2.8，放置4h左右，破坏其中的青霉素N，然后过滤，滤液用Amberlite XAD-4大孔树脂吸附，以20%丙酮水溶液解吸，再经Amberlite IRA-68吸附，醋酸盐缓冲液洗脱，最后加入醋酸锌沉淀结晶，可制得纯度为95%以上的头孢菌素C锌盐，收率自发酵滤液计算可达70%以上。

采用大孔吸附剂提取头孢菌素C有以下优点：无须考虑极性物质与无机离子的干扰，省去脱盐操作，大孔吸附剂具有优良的选择性，解吸液纯度比离子交换法有较大的提高。但是大孔吸附剂用量大，一般为发酵液体积的一半，而且易被污染，污染严重的不能再生，故要求严格的前处理。此外，大孔吸附剂的解吸与再生，需要大量的丙酮、乙醇等亲水有机溶媒，要求有高效的溶媒回收系统，否则将会影响经济效益。尽管存在以上不足，但由于大孔吸附剂法的产品质量与收率比较理想，目前国内外多数工厂仍采用此法提取头孢菌素C。

3.溶媒萃取法

头孢菌素C侧链的氨基与羟基常形成内盐，水溶性很大，难以用有机溶媒直接提取。因此，先要在发酵滤液中加入某些能掩蔽侧链氨基碱性的试剂，如酰氯、酸酐、异氰酸酯等，将头孢菌素C转化为其N-酰化衍生物，才能在酸性条件下用与水不互溶的溶剂甲基异丁基酮、正丁醇或乙酸乙酯提取。例如，用对硝基苯甲酰氯酰化滤液中的头孢菌素C，经甲基异丁基酮酸化提取，转化成N-（对硝基苯甲酰）头孢菌素C钠盐结晶，收率自滤液计算为90%。这种N-酰化衍生物和头孢菌素C一样，可作为半合成的起始原料。发酵液中杂质较多，酰化剂一般用量大，加之用来提取的多为亲水性溶媒，损耗也大，故溶媒法虽然收率高且质量好，但所得的经济效益往往不足以补偿酰化剂与溶媒的耗费，因此，采用此法的工厂并不多。

4.络盐沉淀法

利用头孢菌素C可与一些二价重金属离子Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Ca2＋、Fe2＋和Pb2＋等形成难溶性络盐微晶沉淀的原理，从头孢菌素C发酵液，或其他半纯化水溶液中提取头孢菌素C。在金属离子盐中，以锌盐用得最普遍。将含头孢菌素C的水溶液调节pH至微酸性（pH 5.5左右），加入醋酸锌搅拌使其溶解，然后加入水溶液体积30%左右的乙醇或丙酮，即逐渐析出头孢菌素C锌盐微晶沉淀，沉淀收率一般约为90%。此法简单，收率高，但由于重金属盐的选择性较差，需在一定浓度下才能析出络盐结晶，故多以半纯化的头孢菌素C水溶液为原料，在应用时与其他方法结合使用。此外，也可利用N-酰化头孢菌素C与某些有机碱形成复盐沉淀的原理，将该方法与溶媒萃取法结合使用。