海洋发光细菌及荧光素酶

图6-12　美国NHD PROFILE-1356010X型食品细菌快速测定仪

1.化学污染物的快速检测

发光细菌的发光强度与某些污染物的浓度呈较好的线性关系，能够稳定、快速地反映环境中的污染物浓度变化；而且检测时间短（5～15min）、灵敏度高（细胞基本物质代谢受到影响前发光反应先被抑制）。海洋发光细菌的发光特性与环境中有毒污染物的毒性有关，可用于毒物的检测。我国于1995年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法（GB/T 15441—1995）。薛建华等在《发光细菌应用于监测水环境污染的研究》中指出，水环境中的汞、苯酚都抑制细菌发光，且抑制程度与汞、苯酚的浓度之间存在着明显的相关关系。吴伟等在《发光细菌在渔业水域污染物毒性快速检测中的应用》一文中，以明亮发光杆菌为指示生物，对渔业区域中污染物的急性毒性进行了检测；同时研究了pH、温度对检测结果的影响。海洋发光细菌种类不同时，发光特性有变化，其最佳的发光条件也不同。目前用微生物测定抗菌素效价很费时，操作也较烦琐，试验证明四环素对明亮发光杆菌发光的影响是在低浓度时刺激发光，较高浓度时则抑制发光，据此，利用发光细菌可以快速测定四环素的效价。因此，利用不同种类的海洋发光细菌的发光特性，可以监测海洋环境中的不同污染物。

此外，发光细菌体内的荧光素酶亦可用于食品生产源头的化学污染物的监测。在正常条件下，荧光素酶在加入一定浓度的底物后能够发生催化反应发出蓝绿光，但与一定浓度的污染物质如重金属接触后，荧光素酶的活性受到抑制，发光强度减弱，减弱的程度与污染物质的毒性及浓度在一定范围内呈线性相关关系。因此，可以从荧光素酶发光强度的变化推断出污染物质的含量。朱兰兰应用细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光体系检测虾肉里Hg2＋残留的检出限为0.0007µg/kg，且方法快速、简便。

2.微生物的快速检测

利用细菌荧光素酶催化的发光特性可用来检测特异性细菌如大肠杆菌、李斯特氏菌等。其原理是利用了噬菌体特异性攻击宿主细胞：将带有细菌荧光素酶Lux基因的噬菌体特异性攻击宿主细胞，荧光发射只出现在被噬菌体感染的细胞，并且与细胞数量呈相关关系。荧光素酶Lux基因可以被置入到大部分的报告噬菌体中特异性攻击其宿主菌，达到快速检测病原菌的目的，该技术具有广泛应用性。利用这种方法检测污染食品中的李斯特氏菌，可将传统的分离、培养、鉴定时间至少为96h缩短至24h，甚至将检测限降至1cell /g，该方法简单、快速、灵敏、容易掌握。

在萤火虫荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内与发光强度呈线性关系，据此建立的ATP生物发光法在微生物检验和食品生产环境清洁度等方面已得到广泛应用。美国NHD PROFILE-1356010X型食品细菌快速测定仪是用一种新的微生物ATP生物发光法测定食品中的细菌污染程度的快速检测设备（图6-12），相对于传统的实验室（48～72h）培养法，该仪器可在短短5min内即完成测试，而且该仪器为掌中便携设备，操作简单、携带方便，可就地即时检测样品，数分钟内得结果。ATP是所有生物，包括细菌中均有的能量分子，测定出样品中细菌细胞的ATP含量，即可得知细菌数。操作时，通过裂解剂裂解细菌细胞，对释放出的细菌细胞内部ATP进行检测。仪器精密度10－18mol ATP，而每个细菌约含有2×10－18mol ATP，相当于可以检测到样品中一个细菌的存在。受到通过萤火虫荧光素酶专一性测定ATP含量推测出微生物数量这一原理的启发，王静雪等人探索了一种应用海洋发光细菌荧光素酶、通过对NADH定量检测进行微生物数量识别的全新方法。NADH广泛存在于一切微生物体内，是具有代谢活性的细胞指示物。在特定代谢时期的微生物细胞中NADH含量相对稳定，其含量与微生物的数量存在正相关系，且不同活细菌细胞内NADH含量基本一致；而细菌死亡后，在胞内酶作用下，NADH将很快被分解。该方法建立了一种细菌荧光素酶：FMN-NADH氧化还原酶体外发光双酶体系，其发光强度与必需底物NADH的浓度在一定范围内呈正相关关系，从而以胞内NADH为检测指标，建立了一种检测水产品中病原菌的方法，具有应用普遍性，且操作简便、准确度高、特异性强。