农药污染的生物修复

我们通常所说的农药是指化学农药，化学农药是一类复杂的有机化合物，根据其用途可以分为杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂、除草剂以及植物生长调节剂等。根据化学结构又分为有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂、除草剂和杀菌剂，还有其他农药如脲类化合物、氯代酚、有机氮或有机硫化合物等。

目前，世界上生产的化学农药主要有420种，全世界的化学农药产量（以有效成分计）：1950年为20万吨，1960年为60万吨，1970年为150万吨，1975年为180万吨，自1985年后维持在200万～250万吨。由于世界耕地面积的减少和高产优质品种的开发，进入20世纪90年代以来，化学农药产量、销售额增长趋缓，全球化学农药销售额基本稳定在270亿～300亿美元。我国约有病害742种，虫害（包括螨害）838种，杂草707种，鼠害20种，其中使农作物严重减产的病、虫、草害有100多种。化学农药在农牧业的生产保收和人类传染病的预防和控制等方面发挥了不可磨灭的作用。联合国粮农组织（FAO）统计资料表明，全世界由于使用农药防治病虫害挽回的农产品的损失占世界粮食总产量的30%左右。对我国这样一个在世界上人口最多、人均耕地少的人口大国，农药对缓解人口与粮食的矛盾发挥了重要作用。

但另一方面，农药残留不仅污染大气、土壤和水域，毒化和危害自然环境，更直接残留在作物各个部位，污染农产品及其加工制成的食品，影响农产品和食品的质量，直接危害人们的身心健康，甚至引发社会恐慌，成为社会不稳定、不和谐的因素。

据统计，目前我国喷施的农药一般有40%～60%直接降落、残留在土壤中，5%～30%的农药飘浮于大气中，但最终也通过降水返回地面，进入土壤。因而，土壤成为农药污染最大的目标（图8-1）。

图8-1　农药污染及其侵入机体的途径

我国沿海各县每年使用的农药达18万吨。海洋虽然不是农药的直接使用区，但由于水体及大气的传送作用，海洋在不同程度上也受到农药的污染，滩涂和沿岸水体尤其严重。经常被检出的有机氯农药主要有DDT、六六六、艾氏剂等。

其中据估计全世界生产的DDT大约有25%已被转入海洋，虽然有的国家已禁止使用或停止生产，但因其在环境中十分稳定，不易被分解，在自然界及生物体内可以较长时间存在，通过食物链富集，毒性增大，导致鱼类和鸟类的死亡，甚至在南极大陆定居的企鹅体内都有DDT的存在，对人类的健康也构成了威胁。美国海洋生物学家雷切尔·卡森的《寂静的春天》一书中，列举了大量的事实来说明DDT对生态环境的严重影响。书中提到：“一种奇怪的寂静笼罩了这个地方。园后鸟儿寻食的地方冷落了。在一些地方仅能见到的几只鸟儿也气息奄奄，它们战栗得厉害，飞不起来了。这是一个没有声息的春天。”20世纪70年代起，美国及西欧等发达国家和地区开始限制和禁止使用DDT。我国于1983年宣布停止生产和使用DDT。

食品中的农药残留途径主要有：

（1）施用农药后对作物或食品的直接污染。

（2）大气、水、土壤的污染造成动植物体内含有农药残留，而间接污染食品。

（3）来自食物链和生物富集作用，如：水中农药 → 浮游生物 →水产动物 → 高浓度农药残留食品。

（4）运输及贮存中由于和农药混放而造成的食品污染。

1.降解农药的微生物种类

利用微生物降解农药的研究始于20世纪40年代末，至今已取得了很大进展。自然环境中存在的一些微生物在农药降解方面起着重要的作用，许多研究人员已经通过富集培养、分离筛选等技术发现了许多能够降解农药的微生物。这些微生物包括细菌、真菌、放线菌和微藻等，其中起主要作用的是细菌类，这与细菌生化上的多种适应能力和其更容易诱发突变以及环境条件有关。

图8-2是有机污染物被微生物降解的代谢主干图。

Mandelbaum等从土壤中分离出一株Pseudomonas sp.能降解除草剂阿特拉津，能以阿特拉津为唯一氮源，在90min内使100mg/L阿特拉津完全降解。郑永良等从长期受有机磷农药污染的土壤中分离到一株甲胺磷降解菌HS-A32（不动杆菌属），能以甲胺磷作为唯一碳源和氮源生长，在30℃，pH为7时，对浓度为1000mg/L的甲胺磷降解率达82%。李海雷等从生产甲基对硫磷的农药厂污水曝气池中分离到一株能以甲基对硫磷及其降解中间产物对硝基苯酚为唯一碳源生长的菌株L-W，经鉴定为节杆菌属，其在7h内对50mg/L甲基对硫磷降解率为85%，对50mg/L对硝基苯酚的降解率达到99%。戴青华等从长期经有机磷农药污染的土壤中分离到一株能高效降解三唑磷的菌株mp-4，经鉴定为苍白杆菌属，能以三唑磷为唯一碳源生长，降解率为98.3%；在水稻大田试验中，米壳的三唑磷去除率为91.9%，糙米的三唑磷去除率达到100%。王丽红等从三唑磷生产厂周围的土壤中用土壤富集的方法筛选分离出一株三唑磷降解菌Klebsiella sp.，它能以三唑磷为唯一碳源、唯一氮源、唯一磷源生长，同时实现对三唑磷的降解。表8-3则列出了目前已报道的可以进行农药降解的微生物的种类。

图8-2　有机污染物被微生物降解的代谢主干图

表8-3　可降解农药的微生物种类

2.农药的微生物降解机制

随着微生物降解农药研究的愈加深入，对于其降解机理也愈加清晰。微生物对农药的作用方式分为两大类：

一类是微生物直接作用于农药，其实质是酶促反应。即化合物通过一定的方式进入微生物体内，无论是共生还是单一的微生物对农药的降解大多都是在酶的参与条件下进行的，经过一系列的生理生化反应，最终将农药完全降解或分解成相对分子质量较小的无毒或毒性较小的化合物。常说的农药微生物降解多属于此类。其整个具体过程如下：首先农药吸附于微生物表面，然后穿透细胞膜进入细胞内部，与微生物所产生的降解酶结合发生酶促反应，以达到降解农药的目的。微生物直接作用于农药常见的降解途径有氧化、脱氢、脱卤、脱羧、还原、水解、合成、异构化等几种反应类型。

这些降解酶有的是微生物固有，有的则是由于变异而产生的。降解酶往往比产生这些酶的微生物本身更能忍受异常环境条件，由于降解菌在农药浓度较低时，可以利用其他碳源而不能有效地利用农药为碳源，此时酶的降解效果远胜于产生这些酶的微生物本身，再加上酶的固定化技术可以使酶更加稳定，因此，关于降解酶的研究已成为热点。最近，随着分子生物学技术的迅速发展，对农药降解微生物的功能基因组研究，利用转基因技术构建对农药高效降解的工程菌研究也取得了成功。

Derbyshire等从无色杆菌提取呋喃丹酯键水解酶，并将该酶纯化，纯化后的水解酶对较低浓度的呋喃丹和西维因具有较好的降解效果。Schenk等从节细菌ATCC33790分离到PCP脱氯酶，它可以催化PCP转化成为2，3，4，5-四氯氢化奎宁。Munnecke从混合菌中提取了对硫磷水解酶，其22℃水解对硫磷速度比化学水解（0.1mol/L NaOH，40℃）快2450倍，对其他有机磷酸酯类杀虫剂（甲基对硫磷、二嗪农、毒死蜱、三唑磷、杀螟松、杀螟腈、对氧磷）的水解比化学水解快40～1000倍。Maloney等从吐温-80为碳源的无机盐基础培养基中分离到降解菌Bacillus cereus SM3，该菌能够降解拟除虫菊酯，与降解反应有关的酶称为氯菊酯酶，这是用细胞粗酶液降解拟除虫菊酯的第一个例子。西班牙Sogorb等研究过用酶对拟除虫菊酯类农药进行脱毒和解毒，发现酯键的水解将导致拟除虫菊酯类农药的解毒，而羧酸酯酶对拟除虫菊酯类农药的解毒可能起重要作用。Yu等用海藻酸钙凝胶将产碱菌Alcaligenes sp.YF11中提取的降解酶进行固定化，测定了固定化酶对氰戊菊酯、杀灭菊酯的降解特性，并制成了固定化酶反应器，为降解酶投入实际生物修复应用奠定了基础。

农药降解常见的直接作用方式主要有矿化作用和共代谢作用。

所谓矿化作用就是指微生物直接以农药为碳源，将其完全无机化的过程，是与微生物生长相关的过程。被矿化的化合物作为微生物生长的基质和能源，但通常只有部分有机物被用于合成菌体组成物质，其余部分形成代谢产物，如CO2、H2O、CH4等。矿化作用是最理想的降解方式，因为农药被完全降解成无毒的无机物。

共代谢作用（co-metabolism）是指微生物在有其可利用的碳源作为初级能源时，对原来不能利用的物质也可进行分解代谢的现象。通常情况下，共代谢只能使有机物得到修饰或转化，不能使分子完全分解。共代谢作用在农药的微生物降解过程中发挥着主要的作用。门多萨假单胞菌DR-8菌株降解甲单脒生成2，4-二甲基苯胺和NH3，而DR-8菌株不能以甲单脒作为碳源和能源生长，只能在添加其他有机营养基质作为碳源的条件下降解甲单脒，且降解产物未完全矿化，属于共代谢作用类型。许育新等的研究表明了氯氰菊酯降解菌CDT3能以共代谢方式降解氯氰菊酯。张松柏等从农药厂污泥中分离到一株能降解甲氰菊酯的光合细菌PSB07-19，该菌以共代谢方式降解甲氰菊酯，降解率为45.51%。

另一类是通过微生物自身的活动改变了化学或物理环境而间接对农药起到降解的作用。

3.农药降解菌作用方式举例

高效氯氰菊酯（cypermethrin），分子式为C22H19Cl2NO3，相对分子质量416.3。化学名称为（RS）-α-氰基 -3-苯氧苄基（1RS）-顺，反 -，2-二氯乙烯基）-1，1-二甲基环丙烷羧酸酯，分子结构式为：

高效氯氰菊酯具有触杀和胃毒作用，无内吸和熏蒸作用，杀虫范围广，可用于防治大田作物、蔬菜、果树、林木储藏及卫生害虫，作用迅速，对光热稳定，持效期较长（4周），对某些害虫的卵具有杀伤作用，对水生动物、蜜蜂、蚕极毒，还对有些害虫有拒食活性。急性经口毒性值取决于下述因素：载体、样品的顺反比、种类、性别、年龄、生长阶段等，急性经口LD50的典型值：大鼠为251～4123mg/kg，小鼠为138mg/kg。对皮肤有轻微刺激，能引起过敏，对眼睛则有中等刺激作用，属中等毒性杀虫剂。

高效氯氰菊酯是我国用量较大且使用时间很长、应用最为广泛的菊酯类杀虫剂，与传统的有机磷类农药相比，其有着对环境安全、效果更好、亩投入成本低的优势。尤其自2007年以来，甲胺磷等高毒农药退市，高效氯氰菊酯更是作为替代药物被大量使用。国标中对其在食品中的限量作了明确规定：小麦、黄瓜、棉籽中高效氯氰菊酯最大残留限量为0.2mg/kg；玉米、大豆中高效氯氰菊酯最大残留限量为0.05mg/kg；豆类蔬菜及果菜类蔬菜中高效氯氰菊酯最大残留限量为0.5mg/kg；叶菜类蔬菜中高效氯氰菊酯最大残留限量为2mg/kg，每日允许摄入量（ADI）限制为0.05mg/kg体重。

当农药的残留量为原施用量一半时所用的时间称为半衰期。农药的半衰期常用来表示农药的稳定性。半衰期长，农药稳定，不易降解，容易被植物、动物吸收而通过食物链对人体造成毒害。郑玲玲等从农药厂污水口污水中分离到琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）MLq，以共代谢方式降解高效氯氰菊酯，培养84h对400mg/L高效氯氰菊酯降解率为70.05%。研究发现，高效氯氰菊酯在pH 9条件下自然降解速率较快，半衰期为16.05d，在pH 5的水中的降解较慢，半衰期为28.88d，在海水中的降解半衰期与pH 7的水体接近；而接种琼氏不动杆菌后则表现出在中性条件下的降解优势，高效氯氰菊酯半衰期相比较未添加降解菌明显缩短（图8-3）。

图8-3　琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）MLq对高效氯氰菊酯的降解动力学过程