抗性检测技术

在多年应用有机合成杀虫剂防治后，医学昆虫对多种杀虫剂亦普遍产生了抗性（resistance），而且还在不断的增强。昆虫抗性也称为抗药性，通常可以分为生理抗性和行为抗性。通常说的抗性主要为前者，是指昆虫反复和大量接触同种杀虫剂后对原本敏感的杀虫剂的敏感性下降的特性。昆虫对杀虫剂的抗药性是昆虫作为生物体的一种基本的防御特征。医学昆虫的抗药性与用药量、用药频度和它们的自身特性有关。抗药性的产生，会导致作物保护和疾病传媒防治工作的失败，从而侵害人类的利益，甚至威胁到人类的生存。

抗性检测有三个目的：①控制计划实施前检测为选择杀虫剂和防治计划提供基本的资料；②抗性的早期检测可及时的执行某一有效措施，晚期检测可阐明疾病控制失败的原因及时更换杀虫剂；③定期检测可了解抗性治理的效果。

常见的抗性检测技术有：

（一）生物检测法

抗性检测中的经典方法。此方法衍生于传统的杀虫剂毒力测定方法，根据昆虫不同龄期以及在不同处理天数下，对不同杀虫剂的敏感性差异确定抗性。杀虫剂的给药方法主要有点滴法、药膜法和浸液法等。

其中检测的几个重要指标为：LC50（半数致死浓度）、LC99、斜率（b）和半数击倒时间（KT50）。抗性系数（RR）＝抗性昆虫LC50／敏感昆虫LC50亦有RR＝抗性昆虫KT50／敏感昆虫KT50的算法。WTO（1976）提出以敏感品系LC99×2的剂量作为区分剂量，确定死亡率98%～100%为敏感（S级），80%～98%为初级抗性（M级），80%以下为抗性（R级）。此法虽简便、成本低、重复性好，但用时长、需要大量活虫、难以检测个体的抗性频率且易漏检低频率抗性。

曾晓芃（2004）对分别采用点滴法和药膜法检测了德国小蠊抗药性检测方法。具体方法是：

1．点滴法　设置含不同浓度原药的丙酮液，将1μl的丙酮液点滴于经乙醚麻醉的雄性德国小蠊的第2、第3对足基节间的胸腹板上，虫龄为羽化后7～15d，对照点滴丙酮。各级剂量及对照各滴l0只，受药后转入清洁容器内，供水、供食，24、72h后检查死亡率，重复3次。如对照组死亡率＞20%，则用Abbott公式校正。用Finney的概率值分析法编制的软件进行结果统计分析，求出毒力回归线、LD50和抗性系数。

2．药膜法　用丙酮将各种杀虫原液配制成0．05%稀释液。取2．5ml稀释液于500ml锥形瓶中，匀速转动瓶子，使药液均匀于瓶底和瓶壁，放置过夜，使丙酮全部挥发。各瓶颈处均涂液状石蜡和凡士林的等量混合物。每瓶放试虫10只，在规定时间观察其击倒数，直至全部击倒，并观察24、48、72h死亡率。每种杀虫剂均做3次重复实验，设立丙酮为无药对照组。求出KT50和95%可信限及抗性系数。

（二）细胞电生理检测法

杀虫剂扰乱了昆虫正常的生理活动，中毒作用中受影响最大的是神经信息传导系统。在这一过程中，必然涉及信息传递、神经电兴奋性和相关物质的分泌等生理活动。这些活动与细胞膜上各种离子通道密切相关，电压钳和膜片钳技术等细胞电生理技术是研究细胞膜离子通道最基本和最直接的实验方法。电压钳技术研究天然毒素及合成杀虫剂的基本作用靶—离子通道；膜片钳技术是建立在电压钳基础上的一种新技术，可在很小膜面积上进行电压钳制，可将细胞膜上一个通道的电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流，可对单个细胞的电生理和药理特性进行详尽分析。

（三）生化检测法

生物化学检测法是通过检测单个昆虫的生化抗性来检测昆虫抗药性，目前主要检测昆虫体内与抗性有关的酯酶、不敏感乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽S转移酶等。

1．酯酶（EST）测定　酯酶活力可用α－乙酸萘酯（α－NA）或β－乙酸萘酯（β－NA）作底物测出。李士根等（2002）采用微量滴定板法测定蚊虫非特异性酯酶检测抗药性，具体方法是：将单个淡色库蚊Ⅳ龄幼虫放在Eppendorf离心管中，加入100μl PBS（pH　6．8），碾碎匀浆后，再加入900μl同样PBS混匀，10　000r／min离心10min，取上清液作酶源。将90μl酶液加至96孔微量滴定板孔中，每孔再加90μlβ－NA溶液，25℃下10min，每孔再加90μl坚固蓝B盐溶液，反应5min，即刻将微量滴定板置于MB－Ⅲ型酶标仪上，在550nm波长下读取OD值。PBS作为空白对照。

2．不敏感乙酰胆碱酯酶（AChE）测定　乙酰胆碱酯酶（AChE）是有机磷和氨基甲酸酯的共同靶标。AChE敏感性降低是蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯产生抗性的重要机制之一。测定不敏感AChE可检测有机磷和氨基甲酸酯两类杀虫剂的抗药性。

不敏感AChE的测定要依据AChE的测定，多用Ellman（1961）提出的乙酰硫代胆碱－二硫双硝基苯甲酸法（ATch－DTNB法）。原理是：以ATch为底物，在胆碱酯酶的作用下可水解为硫代胆碱及乙酸，然后以DTNB为显色剂反应而生成黄色产物。可采用微板法测定，反应结束后用酶标仪读取OD值。汪中明（2001）检测家蝇种群不敏感AChE所采用的方法是以敏感品系AChE的I90值作为抑制剂浓度检测单个AChE被抑制残存活性，每个种群测定100头，综合考虑实验误差和对敏感种群的具体检测情况，初步确定AChE残存活性＞20%的个体为具有不敏感AChE的个体。

3．谷胱甘肽－S－转移酶（GST）测定　昆虫体内谷胱甘肽－S－转移酶活性增高在昆虫对DDT和有机磷的抗性中起作用。GST活力测定可用谷胱甘肽和1－氯－2，4－二硝基苯（CDNB）作底物，反应后在340nm波长下测光密度值。可用微量板孔测定法测定单个蚊虫的GST活力。

（四）免疫学检测法

抗性的免疫学检测是从昆虫高抗性品系提取解毒酶，制备单克隆抗体或多克隆抗体，以ELISA法检测相关酶。其适用于解毒酶活性增强产生的抗性。

（五）分子生物学检测法

分子生物学检测法敏感性高，尤其在样本同时存在几种抗性机制时，可准确检测，并可同时从DNA水平进行抗性机制研究。

目前主要采用核酸探针技术和PCR等方法。马磊等（2002）用淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关胰蛋白酶核酸探针检测淡色库蚊溴氰菊酯抗性。采用逆Northern鉴定抗药性品系和敏感品系中胰蛋白酶的表达差异，用随机引物法标记鉴定后的胰蛋白酶cDNA片段为探针Northern blot检测淡色库蚊的抗药性。逆Northern显示胰蛋白酶在抗药性品系中的表达量是敏感品系的4．33倍。以其为探针Northern blot检测显示，胰蛋白酶基因在抗药性品系中高表达，抗药性品系中胰蛋白酶的表达量是敏感品系的3．90倍。细胞色素P450是拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢酶，然而从昆虫中纯化、鉴定P450的技术难度大，研究证实核酸探针可作为一种新的抗药性检测的分子生物学方法且胰蛋白酶核酸探针可用于区分抗药性品系和敏感品系。另外，马磊（2005）用荧光RT－PCR检测蚊溴氰菊酯抗性的研究。用荧光半定量RTPCR检测NYD－Tr基因在淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系与敏感两品系中的表达差异，证明此法可达到检测蚊虫抗性的目的。