昆虫细胞培养技术

昆虫细胞培养技术近年来发展很快已广泛应用于昆虫学研究的各个领域，在昆虫病毒、昆虫生理活性物质、细菌毒素的生物鉴定及果蝇遗传学的研究中发挥了很大的作用；昆虫培养细胞可作为宿主的真核表达系统已被广泛应用于生产外源蛋白质，特别是成功表达大量的具有很高医药价值的活性蛋白质具有广阔的应用前景。

（一）在医学中的作用

昆虫培养技术可用于：①虫媒病的研究：细胞培养技术可在严格控制的实验条件下，简化影响过程，可用于研究较为复杂的病原体在媒介体内发育、繁殖的过程及从细胞和分子水平探讨生物易感性。②杀虫剂的研究：在培养细胞中施加杀虫剂，研究其作用机制，是一种体外迅速筛选杀虫剂的方法。药物直接作用于细胞可通过直接观察药物的细胞毒效，观察细胞的形态结构及数量等的改变，观察损伤的修复、染色体的改变等来综合评价杀虫剂的药效。③基因工程控制虫媒病：几乎任何真核生物或原核基因都能借助杆状病毒为载体在培养的昆虫细胞内表达。

（二）方法

以下将简单介绍昆虫细胞的培养方法：

1．培养基　培养基的选择是昆虫细胞培养中的关键环节，其成分的选择模拟昆虫血淋巴成分。

不同虫种甚至同一虫种的不同发育期的血淋巴成分亦可不同，所以在培养之前应通过理论分析结合预试验选择合适的培养基。常规的细胞培养需要添加动物血清，但取胎牛血清对供血胎牛引起伤害，且有血清培养存在局限性（来源困难、价格昂贵、质量不稳定、批次之间的差异大，重复性差、支原体和其他异源病毒的重要来源、血清成分十分复杂，给基因工程表达产物的后处理带来困难）因此开发无血清昆虫细胞培养基（serumfree media，SFM）是今后昆虫细胞产业化的必然趋势。现有的培养基主要分为三类：①昆虫细胞培养基：是昆虫细胞培养的专用培养基。常见的有Grace、BML－TC／10、IPL－41、M＆M、MGM－443、MGM－448、MGM－450和MM培养基。其中MM培养基为最常用；②适用于医学昆虫的脊椎动物细胞培养基：Eagle′s培养基、L－15培养基和TC199培养基等③无血清培养基：经证实一些蛋白质水解物（如：水解乳蛋白、酵母提取物等、微量元素、维生素、脂类物质等）支持昆虫细胞的生长和增殖。目前，商品化的昆虫细胞无血清培养基有SF－90、EX－CELL400、SFM－5、CDM和ISFM等。

Ardila A等（2005）用L－15／Grace培养基培养含胚卵，添加20%小牛血清及抗真菌剂和抗生素，pH　6．8～7．0，28℃，成功地进行了埃及按蚊的培养。

2．生长条件　昆虫生长有一定的温度条件，一般多在20～30℃之间生长，但最适培养温度为（29±1）℃。在此范围内，温度偏高能加速细胞繁殖；过高则使细胞生长减弱，在33℃下细胞完全不分裂，至37℃就会引起生长抑制和细胞死亡。温度不低于0℃时，能抑制细胞代谢，并无伤害作用。在偏低温度下，其代谢降低，生长速度减慢，却维持时间延长，但若温度太低，可因胞质结冰而死亡，如加入适量保护剂（如二甲亚砜和甘油等）可使冰点降低，此法可用于保存细胞。

另外，氧和二氧化碳都是细胞生存必需的条件之一；光对昆虫细胞影响较大，应该避免日光直接照射而在黑暗中进行培养，并应避免紫外线的照射防止损害细胞。

3．组织的选择和处理　选择组织的原则应是病原体增殖和发育合适的组织或者器官，首选应是媒介昆虫的成虫。但培养技术至今难以解决已分化的组织细胞连续传代的难题。

组织处理步骤一般为：清洗、消毒后剪碎、消化组织。

4．昆虫细胞大规模培养的方法　大规模培养昆虫细胞的方法很多，综合起来可分为两种类型：贴壁细胞培养和悬浮细胞培养。

（1）贴壁培养：以滚瓶培养和微载体培养方法为主。

Vaughn（1976）首次成功地用670cm2生长面积的滚瓶培养了草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda），（Smith）细胞系（sf），其细胞产达到（3× 108）～（5×108）细胞／瓶。Weiss等进一步改进了滚瓶培养技术，每种滚瓶都可使接种细胞浓度增加20多倍。滚瓶培养与大容量培养瓶培养相比，大大增加了细胞培养空间和贴附面积，并能节约时间和精力。

彭建新（1993）报道斜纹夜蛾细胞系（SL－1）和家蚕细胞系（BmN）在国产GT－1，GT－2（华东化工学院生化工程研究所）做微载体正常生长增殖。载体用pH6．8的puck′s液浸泡膨胀过夜，0．7 kg／cm2高压灭菌15min再用培养基（Tc－100辅加10%小牛血清）浸泡几小时备用。以3mg／ml微载体培养细胞，接种斜纹夜蛾细胞的浓度为2× 105个／ml，家蚕为2．5×105个／ml，置CO2培养箱恒温培养，并定时摇动，4d后两种昆虫细胞生长最高密度分别为8．2×105和7．6×105个／ml。

（2）悬浮细胞培养：常用转瓶培养、气升发酵罐培养和灌注培养等方法。

Vaughn（1968）用转瓶培养培养了大蚕蛾细胞，用磁力棒在外加磁力作用下转动以搅拌悬液进行培养。在培养基中加入0．15%的甲基纤维素（400cp）保护细胞免受搅拌引起的剪切力损伤。赵佼等（2000）应用自制的无血清培养基IC—SFM考察了不同转瓶结构对粉蚊夜蛾细胞BT1－Tn－5B1－4悬浮生长的影响，较好地解决了昆虫细胞无血清培养技术的一些不足之处。

气升发酵罐培养是直接以空气为动力来搅拌细胞悬液进行培养。Maiorella（1988）等成功地用21L气升发酵罐培养sf细胞，并在培养基中加入pluronic polyol F－68（0．1%W／V）以防充气对细胞的损坏及将气泡直径控制在0．5～1cm，防止在培养基表面形成泡沫。

Weiss（1986）等曾用灌注培养法培养sf细胞来生产杆状病毒。用灌注泵将消耗的培养基泵出，注入新鲜培养基继续培养。并通入无菌空气以维持溶解氧（DO）量。

5．其他　昆虫细胞培养结束后还应进行活细胞计数、去除污染和保存等。

细胞生物学研究中有许多鉴别统计细胞存活（或死亡）的方法。它大致可归纳为五类：染色血球计数法、电子细胞计数法、核素掺入法、细胞蛋白质含量法和比色法。其中MTT（四唑盐）法是比色法中一种很准确的方法，周青春等（1998）对其进行了改进，选用pH为4．5的3%SDS异丙醇作为溶剂，试验表明最佳昆虫细胞MTT测定方法包括以下5个步骤：①每孔加入20μl MTT溶液（5mg／m1）；②27℃培养4h后，弃上清液，每孔加入200μl pH为4．5的3%SDS异丙醇；③室温，混合器振荡30分钟左右，以及④置ELISA仪读数，测定波长为560nm，参考波长为690nm。

排除污染一般采用抗生素、巨噬细胞共培养、小鼠皮下腹腔过继培养等排除细菌、真菌、病毒和支原体等。细胞的保存一般可采用甘油或者二甲亚砜为保护剂进行冷冻保存，并在使用前进行复苏。