技术在医学昆虫学中的应用

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是1985年由美国Kary Bank Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。PCR技术具有特异、敏感和快速3个显著特点，可在数小时内获得纯度极高的目的DNA片段，被广泛应用于医学、生物学、农学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了巨大影响。

（一）基本原理

PCR是一种在引物介导和耐热DNA聚合酶作用下体外模拟天然DNA复制过程的酶促反应，包括高温变性、低温退火、适温延伸三个阶段，具有高度的特异性和敏感性。PCR采用一对寡聚核苷酸作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成周期性多次循环，使目的DNA片段得到扩增。经25～30个循环后，扩增倍数可达106，理论上可检出样品中单一拷贝的DNA片段。

PCR问世后，为适应不同需求，新的PCR技术不断涌现，进一步提高了其特异性和敏感性。如反转录PCR（RT－PCR）是以mRNA为模板，经反转录合成cDNA，再做PCR扩增，故可检测特异的mRNA或其cDNA克隆。若仅有很少的资料，可通过锚式PCR（anchored PCR）对mRNA进行分析。对于只知一侧序列信息片段的扩增，通常可采用反向PCR（inverse PCR）。差异显示PCR（differential display PCR）可以鉴定和分离在不同条件下（如机体或细胞受某种刺激或患有某种疾病）某种基因的表达产物，无需确切的序列资料。随机扩增DNA多态性分析（random amplified polymorphismic DNA，RAPD）是用随机序列引物（通常为10bp）从基因组DNA中扩增出一组大小不等的片段，此种方法获得的扩增产物类型具有种群和个体特异性，可用于昆虫进化研究、种型鉴定和多态性分析。聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）是指应用PCR将目的基因片段扩增后，用限制性内切酶消化不同个体的同源DNA分子，经电泳分离后表现的限制性片段长度差异。这种差异主要来源于基因突变和DNA分子结构重排所引起的限制性内切酶识别位点的改变。PCR－RFLP主要用于昆虫遗传连锁图的构建、遗传系谱分析和数量遗传研究等方面。聚合酶链反应－单链构象多态性（single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products，PCR－SSCP）是采用PCR技术扩增出某一特定的DNA片段，在高温下使双链DNA变性为单链DNA（single strand DNA，ssDNA），然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，ssDNA带在凝胶中位置的差异反映了DNA序列的差异，用于点突变和多态性位点的检测。双链构象多态性（Double－strand conformational polymorphism，DSCP）是在SSCP的基础上发展起来的，二者原理相同，均使用保守引物进行PCR扩增，故结果稳定。但DSCP不需DNA分子变性，可直接进行电泳检测，是昆虫种群生物学研究中一种很有效的方法。

（二）基本PCR技术

与常规的DNA合成反应一样，PCR体系中的基本要素是：①模板DNA，可以是单链或双链，可以是提取的基因组DNA或cDNA，也可以是克隆的质粒DNA或环状DNA。②一对寡聚DNA引物，分别与模板DNA链两侧的3′端序列互补，可使二者间的DNA序列得以扩增。引物长度一般以15～30个核苷酸为宜，以确保较高的PCR扩增效率和特异性。③耐热DNA聚合酶，通常是Taq DNA聚合酶或其类似物，可在高温下（72℃）催化DNA合成，并能在加热95℃时不变性。④缓冲液，提供DNA合成反应所需pH、离子强度等环境。⑤4种单核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），提供DNA合成的原料。

合理的引物设计是PCR反应成功的关键，影响PCR结果的主要因素是热循环中变性与退火温度及缓冲液中Mg2＋离子浓度，此外提高退火步骤的严格性、增加聚合酶稳定性、减少引物与模板的非特异性反应，均可极大提高PCR的敏感性、特异性和产量。

（三）在医学昆虫学中的应用

目前，有关昆虫分子生物学研究已有较多报道。因PCR技术能将极微量目的DNA进行大量扩增，可大大提高对DNA分子的分析和检测能力，故很多种分子生物学技术均以PCR技术为基础，其在医学昆虫学中的应用也相当广泛。

宋社吾等（2002）通过分组织的PCR检测发现，在我国尖音库蚊复合组和白纹伊蚊体内感染的Wolbachia株不仅局限于生殖组织内，在淡色库蚊（Cx．pipiens pallens）和骚扰库蚊（Cx．pipiens molestus）雌蚊卵巢、中肠和胸部肌肉组织中也检测到Wolbachia株，此研究结果的可靠性也得到透射电镜从形态学角度的证实。

李朝飞等（2003）经RT－PCR分析发现，泛素基因在所检测的斜纹夜蛾幼虫多种组织，尤其是脂肪体中均有表达。采用构建的原核表达载体pQEUB，在大肠杆菌M15中高效表达，为进一步研究S．1itura泛素在SpltMNPV感染中的作用打下了基础。

RAPD－PCR主要适用于种群遗传多样性的研究，Kambhampti等（1992）采用RAPD技术对伊蚊的种和种群进行鉴定和区分，并对RAPD的实验技术、统计分析及应用等进行了探讨。其后RAPD在按蚊的种群研究及舞毒蛾（Garnei，1996）、果蝇（陈燕茹，1997）和烟粉虱（邱宝利，2003）等昆虫中均有应用。

嗜人锥蝇（初生）Cochliomyia hominivorax和次生锥蝇C．macellaria幼虫形态相似，只是发育阶段不同，能引起相同的蝇蛆病，从形态学上很难进行鉴别，Litjens P等（2001）根据其线粒体基因片段的PCR－RFLP分析，成功鉴定了这两种幼虫。

Hiss等（1994）首次将PCR－SSCP用于昆虫研究，对5种蚊子线粒体中核糖体RNA（rRNA）进行SSCP分析，银染后检测结果显示：在所有的种群中均可观察到种的特异性电泳类型，而且种内单个核苷酸替代也可检测到，表明PCR－SSCP是一种很好的遗传分析手段。李石柱等（2003）也采用PCR－SSCP技术，对我国多斑按蚊复合体5个成员种的28S－D3扩增产物进行分析，结果显示电泳条带具种特异性，可用于鉴别蚊种。

Atkinson等（1997）在白蚁种群研究中，采用DSCP技术对mtDNA控制区的DNA片段进行分析，证明DSCP是一种昆虫种群生物学研究的有效方法，同时还用双翅目果蝇及膜翅目蚂蚁进行了验证。

PCR是分子生物学技术的典型代表，随着分子生物学新技术的不断涌现和现有技术的不断完善，越来越多的学者将PCR应用于昆虫学研究，这将极大推动昆虫的遗传背景、致病机制、生物利用等方面的实验研究。