干扰技术在医学昆虫学中的应用

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来出现的一种利用小分子双链RNA（double strain RNA，dsRNA）高效、特异的阻断体内特定基因表达或使其沉默，诱使细胞表现出特定基因表型缺失的技术。它是转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS）的一种，由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，曾被Science评为2001年度最重要的成果之一，而被形象地誉为基因敲低（knock down）或基因沉默（gene silencing），已被广泛用于基因功能、基因治疗和新药开发等研究领域。

（一）RNA干扰的机制

RNAi的确切机制尚不清楚，许多研究结果显示dsRNA通过干扰基因组DNA的甲基化、转录后水平降解mRNA及蛋白质的翻译等不同的机制对基因表达进行调控，从而诱导特定基因的沉默。

1．转录后基因沉默机制　外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式导入的dsRNA在细胞内被Dicer酶切割成约22bp的具有双链结构的小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA），这些siRNA具有5′磷酸、3′羟基末端以及两个游离核苷酸突出，这种结构在RNAi调控途径中起着关键性的作用。siRNA与核酶结合形成沉默复合物（RNA induce silencing complex，RISC）。随即RISC中的siRNA在Dicer酶解旋酶活性作用下开始解旋、解链，然后依靠siRNA反义链，通过碱基配对定位到同源mRNA上，此过程需ATP提供能量。部分结合到mRNA的单链siRNA充当引物，以mRNA为模板合成新的dsRNA，新合成的dsRNA仍可被Dicer酶切割而发挥调控作用；部分siRNA在其3′端下游12个碱基的位置由Dicer酶切割mRNA，切割后的mRNA由于没有5′帽状结构和Poly（A）尾巴的保护，很快被其他的核酸酶降解。

2．翻译水平的调节机制　细胞内70bp的茎环结构或dsRNA前体转录物被Dicer／Argonaute复合物特异性识别后，降解成为成熟的大小为21bp、5′端为单磷酸基、3′端为羟基的单链小RNA分子，即小时序RNA（small temporal RNA，stRNA）或微RNA（micro RNA，miRNA）。stRNA与相关蛋白结合成另一种RISC复合体，可识别并结合靶序列的3′端非编译区（UTR），抑制其翻译过程从而调控基因表达。

3．基因组DNA甲基化机制　在植物研究中发现dsRNA可以影响基因组的甲基化修饰及改变染色体结构，从而调控基因的表达，为RNAi的机制带来了极大的补充。若外源基因以多拷贝形式整合到同一位点上形成正向或反向重复，甲基化酶可识别这些重复序列，引起这些基因位点的甲基化。若甲基化发生在启动子则产生转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）；如果发生在编码序列则产生PTGS。dsRNA还可通过细胞内一种名为Polycomb的蛋白质调节染色质构象的“开关”状态。在这一过程中，dsRNA或siRNA通过碱基互补首先与靶DNA序列结合，随后引导Polycomb复合体与邻近序列结合，靶基因随即沉默，这一效应可在细胞分裂后传至下一代。

（二）RNA干扰技术

1．编码区RNAi技术　最初是通过注射或浸泡等方法直接导入dsRNA。该法虽然可以达到关闭目的基因的表达和产生突变表型的目的，但这种表型变化却不能遗传，存在一定的局限性。为解决此技术上的不足，Y Tavernarakis等（2000）将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转复，其产物会形成具发夹环结构的dsRNA，从而产生RNAi，使目的基因沉默，这种改进的RNAi能够在发育的特定阶段出现，且RNA干扰不仅发生在亲代动物本身，还发生于子代动物中，有利于突变的分析。

2．启动子区RNAi技术　启动子区RNAi技术是应用启动子区的dsRNA使内源相应的DNA序列甲基化，使启动子失去功能，致其下游基因沉默。因多基因家族各成员间高度同源，而其启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子区RNAi技术有利于多基因家族各成员区功能的分开研究。

（三）在医学昆虫学中的应用

RNAi技术与其他几种进行功能丧失或降低的技术相比，具有以下明显优点：①RNAi具有高度特异性，对某些特定目的基因的dsRNA转入细胞内仅能使该基因的mRNA发生特异性降解，特异性阻抑该内源基因的功能。②RNA干涉抑制基因的表达具有高效性，低浓度的dsRNA可以产生强烈的阻抑效应。研究表明每个细胞内只要有几分子的dsRNA就能作用于高丰度的内源性mRNA分子，阻抑靶基因的功能。③干涉作用的广泛性：在部分生物中，siRNA分子能通过细胞膜、细胞间和组织屏障被转运，从而使得RNA干扰作用广泛。例如在线虫小肠中微注射稀释的dsRNA分子，在线虫小肠以外的其他组织也产生对靶基因的阻抑效应；如果用含表达目的基因dsRNA载体的大肠杆菌喂养线虫，在体细胞、生殖细胞等中都产生dsRNA介导的RNA干扰；在美丽线虫中RNA干扰不仅发生在亲代动物本身，还发生在子代动物中。④与传统研究基因的方法如基因敲除、诱变等技术相比，RNAi技术具有简单、快速、省时、省力等特点。

综上，RNAi技术比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失，且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，还可在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行，与TDNA技术引起的功能永久性缺失相比，它更受科学家的偏爱。近年来，在医学昆虫学研究中也有报道。

德国欧洲分子生物实验室（European Molecular Biology Laboratory）的Christophides K．博士与其研究小组于2004年3月份在《science》上提出利用蚊本身的免疫系统杀灭其体内疟原虫的新的抗疟战略。他们在研究中发现了若干蚊体内基因，这些基因可影响蚊体内的免疫系统，进而影响疟原虫在蚊子体内的生存发育。例如，当利用RNA干扰技术剔除CTL基因（CTL4与CTLMA2）后，蚊体内对疟原虫的免疫能力极大提高，可将高达97%的疟原虫全部杀灭。

Yuan等（2002）用RNAi技术将果蝇心脏相关基因tinman和无翅基因（wingless）的dsRNA显微注射于果蝇的早期胚胎中，得到与这2个基因突变体完全相似的RNA表型。tinman dsRNA能导致内脏的中胚层缺陷和横纹肌断裂，wingless dsRNA仅影响心脏前体的形成，表明RNAi能在果蝇基因功能的研究中发挥作用。

尽管在短短几年内对RNAi技术的研究已取得了许多重要成果，但尚存在较多理论和技术问题亟待解决。然而，随着人们对RNAi技术的理论认识不断深入，技术手段日臻完善，该技术必将成为我们研究医学昆虫的重要研究手段。