噬菌体表面呈现技术在医学昆虫学中的应用

噬菌体表面呈现技术（Phage display technology，PDT）是利用在改构的噬菌体外壳蛋白质基因PⅢ或PVⅢ区引入外源基因，以融合形式表达外源肽或蛋白，使其随着噬菌体的组装而呈现在噬菌体表面，保持特定的空间构象，并通过免疫亲和吸附法筛选特异性肽或蛋白的一项新技术。因该技术将基因型和表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选系统，自Smith（1985）首先报道将外源蛋白表达在噬菌体衣壳蛋白表面并证实这种融合蛋白仍具有抗原特异性及生物活性后，该技术的应用范围日益拓宽。目前，已广泛用于蛋白质工程改造、单克隆抗体制备、药物筛选及疫苗研制等生物技术的许多领域。

（一）基本原理

噬菌体表面呈现技术以改建的噬菌体为载体，把目的基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使表达产物提呈至载体表面，利用生物分子间的高度特异性，采用免疫亲和吸附法筛选和富集特异性肽或蛋白。该技术实现了基因型和表型的体外转换，使二者直接联系，从而有效地实现了蛋白质构象的体外控制，可在体外获得具有良好生物活性的表达产物。利用噬菌体表面呈现系统可以构建噬菌体呈现文库，如抗体文库、肽文库等。

（二）基本技术

噬菌体表面呈现技术有丝状噬菌体系统、λ噬菌体系统和T4噬菌体系统3种表达系统，其中以丝状噬菌体系统应用最为广泛。丝状噬菌体（filamentousphage）为ssDNA病毒，呈细杆状，其主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白分别是gpⅧ和gpⅢ，二者均有特定的信号肽序列，可引导融合蛋白分泌至大肠杆菌周质腔，经信号肽酶的切割，折叠及组合后，表达具有生物活性的融合蛋白。现以丝状噬菌体为例，介绍其抗体库及肽库的构建。

1．噬菌体抗体库（Phage Antibody Library）

从外周淋巴细胞中提取mRNA，采用与抗体基因两侧保守区互补的引物，通过RT－PCR分别扩增抗体可变区的重链和轻链基因，将这些基因分别克隆到噬菌体载体中（目前常用的噬菌体载体为pComb3及pCANTABLF）表达Fab或ScFv特异性抗体分子片段，并呈现于噬菌体表面，利于筛选。若将固相化的特异性抗原与噬菌体抗体进行吸附，洗去未结合的噬菌体抗体，将结合在抗原上的噬菌体抗体洗脱下来，再感染宿主菌进行扩增，可得到次级库，重复这一“吸附－洗脱－扩增”过程，能获得高容量的噬菌体抗体库。

2．噬菌体肽文库（Phage Peptide Library）先经PCR扩增某特定基因片段后再用DNase I酶解，使其形成长短不一的小基因片段，或体外合成编码短肽的随机DNA片段，再经PCR扩增使其成为携带适当酶切位点的基因片段，然后将各种基因片段克隆至噬菌体外壳蛋白基因区。关于噬菌体肽文库的筛选，可利用呈现的多肽与特定配基亲和结合，高效筛选目的基因。一般是先使亲和配基固相化（可将配基涂布在聚苯乙烯板、琼脂糖珠等固相支持物），使文库的噬菌体与之反应，有亲和力的噬菌体被固相化配基所吸附，经过洗涤、洗脱的噬菌体可再次感染大肠杆菌而扩增。这种“亲和结合－洗涤－洗脱－扩增”的富集过程具有简便、快速、高效的特点。

（三）在医学昆虫学中的应用

近年来，随着网络技术、计算机技术等新技术的发展，世界各国加强了国际间的技术交流和合作，也进一步促进了噬菌体表面呈现技术的研究和应用。在医学昆虫学研究领域，随着基因工程等分子生物学技术的发展，国内外对蚊媒病等医学昆虫传播疾病的致病及防制等方面进行了较多研究。

有关蚊媒和疟疾的最新研究进展表明，可以利用噬菌体表面呈现等技术对蚊虫进行基因操作以降低其传疟能力。Ghosh Ak等（2002）从外源基因导入蚊基因种系概况、组织特异性启动子的特征、削弱疟疾传播能力的转基因蚊及其体内疟疾发育阻碍子的鉴定等四个方面报道了该项研究的最新进展。该研究结果很令人振奋，但是如何向野生蚊种传播该疟疾发育阻碍子仍是一个有待解决的问题。

美国学者Shanmugavelu M等（2000）自烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫噬菌体呈现文库中分离出一个732bp的cDNA，其翻译的蛋白为P29（分子质量约29kD）。经Western和Northern分析表明P29蛋白存在于烟草天蛾幼虫脂肪体组织和围心细胞中。结合测定试验表明P29蛋白与保幼激素酯酶结合能力强，扰乱了溶酶体的靶向作用，具有促进围心细胞溶酶体降解保幼激素酯酶的功能。

噬菌体表面呈现技术自建立以来，因其具有方便地获得目的分子DNA序列和可在体外（细菌外）完成对外源多肽的研究等明显优势，被广泛应用于生命科学各个研究领域。同时，该项技术还存在库容量、不能进行氨基酸修饰及蛋白质的糖基化等问题。综上，随着该项技术本身的不断发展和完善，它的应用范围会日益拓宽，必将在生命科学的许多领域产生深远的影响。