蛋白酶抑制剂的筛选

艾滋病（AIDS，获得性免疫缺陷综合征），是20世纪危害人类健康和生命最严重的疾病之一，其病原体为人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）。HIV蛋白酶归属于天冬氨酰基蛋白酶，由两条含99个氨基酸的多肽链形成C2对称的均二聚体，每一亚基上天冬氨酰残基形成了酶的活性中心。HIV蛋白酶（HIVPR）对该病毒复制周期的正常运转和病毒毒粒成熟至关重要，是病毒复制必需的酶，是抗HIV的药物重要靶点。

至今已有许多抗HIV的药物。药物设计、筛选的一般做法是以现有的药物作模板进行数据库搜索，即基于药效团的搜索或相似性搜索。但是，现有的小分子化学数据库已被广泛利用，反复搜索过了。而中药、天然物的有效成分的提取进展得非常快。中药化学数据库已经建立起来。如何利用数据库筛选新的活性低毒化合物是中药现代化的一个重要环节。本节介绍利用现代化学信息学手段和中药化学数据库寻找新的抗HIV药物的初步结果。

10.2.1 中药数据库的搜索

所用的数据库是中科院过程工程研究所分子设计课题组开发的中药化学数据库（Traditional Chinese Medicines Database，TCMD2003.1）。搜索的方法是相似性搜索。首先计算数据库里的所有分子的指纹（fingerprint），将其存入存放中药分子的数据库里。指纹是由特征组成的，比如：

U=｛是否芬族一化合物，有否环，卤素，C，N，O，S，P｝

有几种方法计算指纹，比如，MDLMACCS钥匙（keys）、类型图形距离（typed graph distance，TGD）和类型图形三角（typed graph triangle，TGT）。

然后计算模板分子的指纹并与数据库里的分子的指纹比较。为此需要定义一个量度，一般是采用Tanimoto系数，它是介于0和1之间的一个数值，0和1分别代表最不相似和最相似。Tanimoto系数的定义可用以下公式表示：

#AB/（#A+#B-#AB）

这里#AB、#A和#B分别代表A与B共同的特征数、A的特征数和B的特征数。将模板分子的指纹与数据库里的中药化学分子的指纹逐个比较，相似性超过70%的分子被标记并存放到结果数据库里，即得到了搜索结果。沙奎那韦（Saquinavir，Invirase，SQV）是较早上市的抗HIV的药物，它可以作为数据库搜索的模板。TCMD数据库有9000多个分子，根据以上所描述的搜索方法，选用MDLMACCS钥匙（keys）方法计算指纹，得到了约50个与沙奎那韦相似的分子（见图10-18）。下一步的工作是以对接（DOCKING）的方法做进一步的筛选。

图10-18 通过相似性搜索筛选得到的与沙奎那韦（Saquinavir）相似的典型分子

10.2.2 分子对接

从晶体蛋白库中选择有蛋白酶-底物复合物的晶体结构，进行分子叠合选出最有代表性的蛋白酶结构（1A30）作为受体蛋白分子。

小分子配体与1A30的初步对接结果表明，亚叶酸分子的匹配最佳。因此，系统研究了亚叶酸分子与蛋白酶1A30的相互作用。系统搜索亚叶酸分子的构象，共得到了2000多个构象，全部与1A30进行对接，结果表明，不同构象的对接结果不同，所以分子构象的选择对于分子对接具有一定的影响。

这里，只报道一个对接筛选得到的药物分子并对对接模拟结果进行详细分析。这个分子是亚叶酸（leucovorin），图10-19为其立体结构，它是从乌药中提取的。此分子与钙结合形成亚叶酸钙，主要用作叶酸拮抗剂（如甲氨蝶呤、乙胺嘧啶或甲氧苄啶等）的解毒剂；用于预防甲氨蝶呤过量或大剂量治疗后所引起的严重毒性作用；用于由叶酸缺乏所引起的巨幼细胞贫血；与氟尿嘧啶联合应用时，用于治疗晚期结肠癌、直肠癌。

将筛选的分子与模板分子作柔性重叠，从而证明该药物分子是一个好的抑制剂候选物。柔性重叠时基于药效团方法（pharmacophore elucidation），其基本思想是若两个配体的生物特性结合得较好，两者会有好的重叠。柔性对接是基于分子的药效团重叠原理而进行的。采用分子的体积、芳环组、氢键给体和受体为药效团，并定义其概率密度为一个高斯函数，通过优化相似函数（-KTlg F+U）而得到分子的最佳重叠。这里U是势能函数，F=Faro+Fdon+Facc+Fvol，其中Faro、Fdon、Facc和Fvol分别是共环基团、氢键给体、氢键受体以及体积的概率函数。

图10-20所示为亚叶酸分子与其模板沙奎那韦的柔性重叠结果。药效团芳环组（aromatic groups）重叠得很好。由于亚叶酸分子中间部位单键较多，其转动势垒很低，分子在活性位点较为灵活。这样可保证其他药效团可与受体较好地结合。通常情况下，除芳环组外，最主要的药效团是氢键给体和受体。氢键的形成可以作为对接好坏的表示之一。从图10-21可以看出，有三个氢键形成。研究人员认为亚叶酸分子与受体结合得很好。

图10-19 筛选得到的亚叶酸分子的结构式

图10-20 亚叶酸分子与蛋白酶抑制剂沙奎那韦（SQV）的叠合（彩图见第408页）

亚叶酸分子为黑色（较重），蛋白酶抑制剂沙奎那韦（SQV）为灰色（较轻）。

图10-21 亚叶酸分子与受体结合的近距图像（彩图见第408页）

（a）中虚线代表的是氢键，其中亚叶酸分子为球-棍表达，受体的残基为棍表达；（b）为亚叶酸周围受体蛋白的分子表面疏水性

为了进一步理解此亚叶酸分子和1A30蛋白质之间的作用机理，给药物改造、设计提供思路，用分子动力学方法研究了它和1A30蛋白质之间的相互作用，探测受体活性中心的势能面轮廓。从对接结果中选出得分最佳的构象和受体的复合结构（见图10-19，其对接得分为-49.35）作为进行分子动力学研究的初始构象。

10.2.3 分子动力学模拟

10.2.3.1 系统的描述

在体系活性位置无水（200ps）的情况下，势能和温度在10ps后趋于平衡。对稳定MD数据进行统计，分析亚叶酸分子与蛋白相互作用。体系活性位置含水（50 ps）的情况下，势能和温度在5ps后趋于平衡。

10.2.3.2 配体的构象变化

选取亚叶酸分子的5个二面角，定义为二面角N7C9C10C17、C10C17N18 C20、C26N27C29C30、C29C30C31C32、C30C31C32O33，观察这5个二面角在动力学过程中的变化（见图10-22）。

图10-22 重要二面角的统计分布（彩图见第409页）

数据表明二面角N7C9C10C17在动力学过程中的变化主要介于60°～90°之间，变化范围较小，它与整个杂环的转动有关，阻力较大，该二面角的变化幅度较小。二面角C10C17N18C20主要介于-150°～-50°之间，其变化幅度较大，原因是四个原子都是单键连接，转动能垒较低，它的两边都是芳环。由于这个二面角柔性较大，分子可以较好地与受体对接。后面的三个二面角都是由单键相连的原子组成。二面角C26N27C29C30主要介于70°～110°之间。二面角C29C30C31 C32在180°左右小幅变化，表明4个原子几乎停留在一个平面之上。二面角C30 C31C32O33角度变化范围极大，几乎没有固定值，二面角自由变化，主要是由于C—O键的自由转动。研究人员注意到二面角C29C30C31C32和C30C31C32 O33变化产生不同的构型的变化趋势与势能的变化趋势基本一致，并且它们的变化与强氢键的形成有关，所以在搜索能量最低构象时应着重考虑这两个二面角。

10.2.3.3 配体与受体之间的相互作用

为考察配体取代基与受体相互作用的情况，将配体划分为以下几个基团（见图10-23）。

图10-23 亚叶酸分子分割图

通常配体和受体是在不断运动的。分子动力学可以模拟其随时间的变化，并计算其各种性质的统计平均以了解药物分子与配体结合的情况，为评估它成为先导化合物的可能性，也为修饰该化合物提供依据。图10-24所示的是配体亚叶酸分子的一些原子与周围受体原子的相关径向分布函数，它代表了一个原子周围找到另一个在特定位置上的原子的概率。原子的编号如图10-21（a）所示。O18与H152和H154都可以形成氢键。两者都是氮连接的氢，由图10-24所示，它们形成氢键的概率几乎相同。而H1263与O19之间只是范德华作用，比氢键弱许多，所以其峰较宽。

图10-24 基团2与周围基团之间的原子径向分布函数

图10-25为基团3与周围基团之间的原子径向分布函数，O474与H29形成了很强的氢键，另外两对之间的相互作用较弱，活动范围较大，峰较宽。发现受体蛋白酶与亚叶酸分子可形成三条氢键，分别为受体蛋白残基ARG8（左）的154号氢原子与亚叶酸分子的57号氧原子，ASP30的474号氧原子与亚叶酸分子的29号氢原子，ARG8（中间）的152或154号氢原子与亚叶酸分子的18号氧原子。这些氢键受热运动的影响随时间变化，较弱氢键的键长的变化幅度较大，但它对于配体分子在靶点的位置起重要作用。

图10-25 基团3与周围基团之间的原子径向分布函数

当模拟达到平衡后，收集统计模拟数据，分析小分子配体与受体相互作用及配体各基团与受体残基作用情况，表10-8～表10-11分别是无水分子和水分子存在时的模拟结果。其中VDW和Elec分别表示范德华作用能和静电作用能。

表10-8 配体与受体分子动力学模拟能量数据（无水）（单位：kca I/mo I）

表10-9 配体取代基与受体残基作用能数据（无水）（单位：kca I/mo I）

表10-10 配体与受体分子动力学模拟能量数据（有水）（单位：kca I/mo I）

表10-11 配体取代基与受体残基作用能数据（有水）（单位：kca I/mo I）

由表10-8可以看出，配体亚叶酸分子与受体HIV蛋白酶（1a30）总结合自由能较低，配体与受体之间发生的范德华作用和静电作用同等重要。由表10-9可以看出，基团4与受体残基作用最强，表明该基团对小分子配体在活性位置的稳定性有重要作用，基团2有较强的静电吸引作用，基团1与受体残基主要产生范德华作用力，它们对配体起构建分子结构骨架、在立体空间使配体与受体稳定结合的作用。

由表10-10可以看出，加水后的模拟体系比无水参与的模拟体系的范德华作用及静电作用均有所增强，但静电作用增强幅度大许多，总结合自由能因此下降。由表10-11可以看出，加水后配体中各基团与受体残基作用增强，各基团与受体作用由强到弱的顺序为：4＞2＞3＞1。与无水情况相同，配体取代基4与受体残基产生强静电吸引力，是小分子配体产生活性的重要部分，其他取代基与受体残基主要产生范德华作用，它们对配体起构建分子结构骨架、在立体空间使配体与受体稳定结合的作用，基团1在有水参与和无水参与的分子动力学模拟中均产生静电排斥作用，其主要作用是与受体产生疏水互补匹配。

基团1在有水参与和无水参与的分子动力学模拟中均产生静电排斥作用，所以在进行结构改造时可加入极性基团，如醛基、羧基等。

有水情况下的分子动力学模拟与无水情况下的分子动力学模拟得到的数据结果对比表明：配体取代基与受体作用强弱的趋势在有水和无水情况下是基本一致的，这说明选取的考察模型具有一定可信度，所使用的统计方法具有正确性。有水存在的情况下，配体与受体的作用能呈现降低趋势，基团活性有所提高。

10.2.4 结论

通过分子对接方法得到的艾滋病蛋白酶与亚叶酸分子最佳构象的复合结构，并进行分子动力学模拟，了解到配体功能团与受体残基结合的细节和变化规律。本节得到的HIV-1蛋白酶与亚叶酸分子的结构模式信息将有助于设计和改造出效果更好的抗HIV-1蛋白酶的抑制剂。