研究发现，花椒素WGX-50能与α7n ACh R受体相结合，并通过激活α7n ACh R受体通路，抑制脂多糖（LPS）介导的炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌；通过下调Bax基因和蛋白表达水平，缓和细胞凋亡；同时，它还能使Aβ解聚。因而，花椒素WGX-50具有良好的神经保护作用。此外，花椒素WGX-50能改善小鼠的学习和记忆能力。作为一种安全的药物，应推动花椒素WGX-50尽早进入老年痴呆症药物制剂的开发和研制。
11.3.1 花椒素与α7n ACh R相结合
将原代SD大鼠神经细胞接种于玻片上，用浓度为50μmol/L的花椒素WGX-50预处理5min后，加入由异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的α7n ACh R特异性拮抗剂银环蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BTX）1.5μg/ml；对照组采用相同体积浓度的DMSO预处理。在4℃条件下孵育15min后，用4%多聚甲醛室温固定15min，之后在荧光显微镜下观察。如图11-16所示，用花椒素WGX-50处理后，相对于对照组而言，结合到神经细胞上的银环蛇毒素明显减少。证明花椒素WGX-50能与α7n ACh R结合，结合位点与银环蛇毒素一致。
图11-16 花椒素WGX-50显著减少了银环蛇毒素与其受体α7n ACh R的结合（彩图见第414页）
将提取的神经细胞膜蛋白，与不同浓度的花椒素WGX-50（A10：0μmol/L， B10：2.5μmol/L，C10：5μmol/L，D10：10μmol/L，E10：20μmol/L）混合，室温孵育30min后，在艾瑞公司生产的Octet Red非标记检测系统上，用带有α-BTX-bi-otin（25μg/ml）探针的生物传感器，检测花椒素WGX-50与膜蛋白中的α7 n ACh R的结合情况。结果显示花椒素WGX-50与α7n ACh R结合（见图11-17）。
11.3.2 花椒素的抗炎活性
神经元细胞外的Aβ集聚具有神经毒性作用，Aβ可刺激神经小胶质细胞产生炎症因子IL-1和IL-6等，导致神经元的损伤和坏死，加速了阿尔茨海默病的发病进程。因此我们在神经小胶质细胞上，考察花椒素WGX-50对LPS诱导的炎症因子分泌的影响。
采用ELISA方法，检测细胞培养上清中细胞因子的分泌水平。用浓度为1μmol/L的花椒素WGX-50预处理细胞30min后，加入100ng/ml的LPS刺激4h，收集细胞上清。同时设置分别用α7n ACh R拮抗剂α-BTX和美加明（mecamylamine，MEY）处理的实验组。
图11-17 不同浓度花椒素WGX-50（A10：0μmol/L，B10：2.5μmol/L，C10：5 μmol/L，D10：10μmol/L，E10：20μmol/L）与神经细胞膜蛋白室温共孵育30min后，在Octet Red非标记检测系统上，用α-BTX-biotin检测到它与α7n ACh R的结合（彩图见第415页）
结果如图11-18所示，LPS能显著增加炎症因子TNF-α和IL-1β在小胶质细胞的分泌水平（P＜0.01）。花椒素WGX-50能显著抑制LPS诱导的TNF-α和IL-1β的生成，抑制率分别为54%和68%。花椒素WGX-50具有良好的抗炎活性。α-BTX和MEY，却能逆转这种抑制作用，说明花椒素WGX-50可能通过激活α7 n ACh R通路发挥作用。
图11-18 不同药物对神经小胶质细胞炎症因子TNF-α和IL-1β（LPS诱导）水平的影响
1：空白对照；2：LPS；3：LPS+WGX-50；4：LPS+WGX-50+BTX；5：LPS+WGX-50+MEY
11.3.3 花椒素对神经细胞的保护性
11.3.3.1 花椒素对神经细胞活力的影响
将原代SD大鼠神经细胞接种于96孔或24孔培养板内，用浓度为1μmol/L的花椒素WGX-50预处理细胞后，加入25μmol/L的Aβ25-35继续培养48h。对照组采用相同体积浓度的DMSO对神经细胞作预处理。采用MTT法检测细胞活力。结果如图11-19所示，花椒素WGX-50显著改善了Aβ25-35诱导的神经细胞毒性，细胞活性由67.7%上升到86.2%。
图11-19 花椒素WGX-50改善了神经细胞活力
11.3.3.2 花椒素对神经细胞凋亡的影响
采用的PI/Hoechst双染法研究细胞凋亡时，不同凋亡时期的细胞荧光色不同，正常细胞呈弱蓝色及弱红色荧光；早期凋亡细胞呈强蓝色及弱红色荧光；晚期凋亡细胞呈弱蓝色及强红色荧光。将用花椒素WGX-50和Aβ25-35处理（对照组采用相同体积浓度的DMSO处理）的大鼠原代神经细胞接种于盖玻片上，先后加入10μg/ml PI/Hoechst33258荧光染料，37℃避光孵育10min，用PBS清洗2遍后，在荧光显微镜下观察。
结果如图11-20所示，花椒素WGX-50显著减少了由Aβ25-35诱导的神经元细胞凋亡数量。再次在细胞水平上证实了花椒素WGX-50的神经保护作用。
11.3.3.3 花椒素下调Bax在基因和蛋白水平的表达
采用RT-PCR和Western blot技术，研究花椒素WGX-50对细胞凋亡调节基因Bax和Bcl-2的m RNA及其蛋白表达水平的影响。用浓度为1μmol/L的花椒素WGX-50预处理大鼠原代神经细胞1h后，加入浓度为25μmol/L的Aβ25-35进行凋亡诱导48h。对照组采用相同体积浓度的DMSO处理。收集细胞后，用Trizol提取各实验组细胞的m RNA和蛋白，分别进行RT-PCR和Western blot实验。
图11-20 荧光显微镜下用PI/hochest双染法研究花椒素WGX-50对神经细胞凋亡的影响（对原图作了反色处理）
结果如图11-21所示，花椒素WGX-50下调了神经细胞中Bax的基因和蛋白表达水平。从蛋白和基因水平进一步证实了花椒素WGX-50的神经保护作用。
图11-21 花椒素WGX-50对神经细胞凋亡Bax和Bcl-2在基因和蛋白水平的影响
11.3.3.4 花椒素对Aβ的解聚作用
将1μmol/L的花椒素WGX-50与浓度为50μmol/L的β淀粉样蛋白Aβ混合，在37℃条件下孵育48h。在原子力显微镜下，观察Aβ的结构变化。结果发现花椒素WGX-50可以将聚合的Aβ解聚（见图11-22）。说明花椒素WGX-50还可以直接作用于Aβ并将其解聚，从而免除Aβ对神经细胞产生的毒性。
图11-22 花椒素WGX-50使聚合的Aβ（a）解聚（b）（彩图见第415页）
11.3.4 花椒素能改善小鼠的学习和记忆能力
选择30只同窝C57BL6/j雄鼠，随机分为3组，采用双盲法给小鼠注射花椒素WGX-50，药量为1mg/kg体重。第6天后再以2mg/1kg体重的东莨菪碱（sco-polamine）处理小鼠，并进行Morris水迷宫实验（morris water maze，MWM）。结果表明，花椒素WGX-50可以有效改善由东莨菪碱所致的小鼠获得性记忆障碍：小鼠穿越平台的次数明显增加，寻找有效路径的效率也明显改善（见图11-23）。
为进一步评价花椒素WGX-50对学习和记忆的作用，以ppr转基因小鼠为阿尔茨海默病模型小鼠，选择鼠龄为10周的同窝ppr转基因阳性雄鼠（ppr+）和ppr转基因阴性雄鼠（ppr-），随机分为2组，双盲法注射花椒素WGX-50或生理盐水（water），10d后进行Morris水迷宫实验。结果显示，花椒素WGX-50无论是对小鼠穿越平台的次数，还是寻找有效路径的效率，都可以有效地改善ppr+转基因小鼠的记忆能力（见图11-24）。
图11-23 花椒素WGX-50对小鼠空间记忆的影响
图11-24 花椒素WGX-50对ppr+转基因小鼠空间记忆的影响
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