相位衬度显微术原理

在通常的光学显微镜中，光波通过物体样品中某种组织，使其振幅比入射前或周围介质的振幅（见图3-1（a）中的参考波）有所减小但相位不变，这就导致该组织与周围介质在图像上产生振幅差，通过图像的强度（等于振幅的平方）差产生衬度，这样的物体称为振幅体（am-plitude objects），如图3-1（b）所示。如果一个物体不吸光（如大多数的透明生物样品），但它们可产生衍射（散射）光，在光通过物体后仅引起光线的相位移而不改变其振幅，这样的物体称为相位体（phase objects）。如果所观察的组织的折射率大于周围介质的折射率（生物样品是通过切片或加染色制样的，因此组织和周围介质几乎有同样的高度），其相位就会被推迟（滞后），如图3-1（c）所示。一般光学显微镜是不能鉴别相位体中组织的，但通过样品中组织与周围介质的折射率的差别可利用相位衬度显微镜（phase contrast microscope）鉴别相位体中的不同显微组织。

相衬原理是荷兰物理学家泽尔尼克（Zernike）于1934年建立的，并在实践中获得巨大应用，由此他荣获1953年度的诺贝尔物理学奖。

图3-1 振幅体和相位体对光波形的影响

（a）具有特征振幅、波长和相位的参考波；

（b）纯振幅体吸收能量和减小振幅，但不改变相位；（c）纯相位体改变相位，但不改变振幅

金相显微镜所观察到的显微组织，通常是通过浸蚀获得第二相组织与基体不同的高度，并利用试样中不同组织或区域（如晶界）反射光的强弱所产生的振幅衬度来鉴别的。如果两种组织的反射系数和高度相差甚微，以致它所反射的光无论强弱所产生的衬度不足以清晰呈现组织形态，这时显微镜即使有足够的分辨率，由于衬度不足，仍然不能区分它们，这在金相组织分析中也会时常碰到。但是利用相位衬度显微镜将微小的高度差转换为相位差，就可鉴别不同的组织，如图3-2所示。下面将分别论述生物样品和金相样品的相位衬度原理。

图3-2 直射波和衍射波经不同高度的相位体后能发生的干涉

当一束相干照明光照射到透明的生物样品上时，相干入射光波将分成两个组分：一个是透射（零级衍射）波（surround wave，S波），另一个是多方向散射的衍射波（diffracted wave D波），S波和D波均被物镜收集并聚焦在物镜的像平面上成像，在像平面上它们的干涉产生合成粒子波（resultan particle wave，P波）。因此，波间的矢量关系为P=S+D。图3-3（a）给出了上述情况中具有确定波长的正弦波S，D和P之间的相位关系。S波和P波的相对强度决定了可视衬度，在图中以实线表示，而D波不能直接被观察到，用虚线表示。衍射D波的振幅远小于直射S波，因为在图像每点上的衍射波光子少于透射波光子。值得注意的是，由于D波与物体的交互作用，它相对于S波在相位上被推迟了λ／4光程差，即推迟π／2相位（δ=2πΔ／λ，式中δ为相位差，Δ（=2Δd）为光程差）。由D波和S波干涉产生的P波相对于S波仅推迟了很小的光程差，约λ／20，并且具有与S波几乎相同的振幅。由于S波和P波具有几乎相同的振幅，在通常的显微镜中图像没有可视的衬度，因此相位体细节不可见。

图3-3 波间的相位关系和矢量图

上述的情况可用极坐标中的矢量来描述，如图3-3（b）所示。矢量的长度表示波的振幅，矢量相对于固定参考矢量（图中为S波矢量），旋转角表示相位移量（角相位移），相位滞后用顺时针旋转表示。反之，相位超前用逆时针旋转表示。这种图称为相位矢量图（phasor diagram）。相位矢量图清楚地描述了D波相位移的程度是如何影响合成P波的相位的。反之亦然。在相位矢量图中，合成P波用S波和D波矢量之和表示。D波相对于S波的相位移在相位矢量图中用Φ表示，图中Φ=±90°+／2，而是S矢量和P矢量之间的相位差。由于很小（对应的光程差约为λ／20），因此φ≈±90°。正如图3-3（b）所示，低振幅的D衍射波与S波干涉后产生一个振幅与S波几乎相等的P波，由于S波和P波振幅几乎相等，图像无可视的衬度，物体不可见。

相衬技术的基本原理：透射波S与衍射波D的相位差近似为±π／2，首先设法使S波的相位超前π／2（称为正相位衬度，见图3-4（a））或推迟π／2（称为负相位衬度，见图3-4（b）），即使S波与D波为反相位（相位差为π）或同相位（相位差为零），以使S波和D波发生相消干涉或相长干涉得到P波。由于发生了加强或减弱的干涉使P波与S波在振幅上有差别但这种差别不足以获得可视衬度。其原因是S波振幅远大于D波，所以还需降低S波的振幅，使之接近于D波的振幅，这种叠加后的P波与S波才有明显的差别，如图3-4所示。由此可见，相衬技术的基本原理就是使S透射波移相位（移相）和减振幅（减幅）两条基本原则。

图3-4 正相位衬度和负相位衬度的原理和红血球的图像衬度的比较

注：矢量图中虚线箭头表示原S波的方向