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影响共聚焦图像质量因素

时间:2023-02-14 理论教育 版权反馈
【摘要】:在针孔处图像亮度是受多因素影响的,包括激光功率、样品中荧光色品密度、物镜的数值孔径、共聚焦倍率因子、光栅扫描速度、荧光滤片组件的选择等。在共聚焦显微镜中,每秒通常能给出2帧512×512像素图像,每秒100帧或更高速率只能实现于有限尺寸的图像。总之,在共聚焦显微镜中光学性能是受诸多因素影响的。如何平衡这些参数来获得高质量共聚焦图像,这与操作者的知识和经验密切相关。

四个主要因素决定了共聚焦图像的质量:①空间分辨率;②光强分辨率;③信噪比;④瞬时分辨率。

空间分辨率是描述图像两点间最小可分辨距离的。沿z轴方向上两点分辨率和图像平面两点分辨率取决于激发波长、荧光波长、物镜的数值孔径和共聚焦扫描头的位置。物镜的数值孔径是至关重要的,因为它决定了扫描样品束斑的尺寸和针孔处共聚焦荧光束斑的尺寸。数值孔径决定空间分辨率的原理前已论述。在共聚焦模式中,激发和发射波长是重要的,在共聚焦光学中可辨的最小距离正比于它们波长的倒数之和。在共聚焦显微镜中,空间分辨率也取决于针孔孔径尺寸、变倍因子和扫描速率。减小针孔尺寸意味着减小了沿z轴方向聚焦面的厚度,因此获得更高的光学截面分辨率,这是高质量投影图像和高分辨三维观察的基础。减小针孔尺寸也改善了图像的衬度,因为失焦光源的光被排除。在某些条件下,共聚焦荧光显微镜在xy平面内的横向分辨率可远高于大视域荧光显微镜,具有超高分辨率。

1995年,韦伯(Webb)给出了共聚焦显微镜x,y水平面内两点分辨率的表达式:

dxy≈0.4λ/NA(6-1)

z轴向分辨率为

dz≈1.4λn/NA2(6-2)

图6-3显示出针孔直径(pinhole diame-ter))对光学截面厚度的作用。针孔尺寸的减小有利于轴向(z方向)分辨率的提高,但损失了水平方向(x,y)的分辨率。

光强分辨率描述了图像中强度的分辨率,它被定义为由模数转换器所赋予图像的灰度数。最大可能的动态分辨率就是探测器的动态分辨率。PMT探测器的动态分辨率被定义为饱和信号与探测器噪声信号之比,它们是以伏特或电子数来计算的。因此,探测器的动态分辨率是一种图像系统的本征特征。为了发挥探测器成像潜能,操作者应尽力获得从黑(无信号)到白(饱和信号)整个动态范围的图像,这可通过调整光学信号的振幅范围来实现。

图6-3 针孔直径对光学截面厚度的作用

信噪比(S/N)定义为图像的可视度。它直接取决于物体和它的背景的振幅,以及成像系统的电子噪声。对于明亮图像,信噪比主要是由物体和它的背景强度所决定的,而对于灰暗图像,图像系统的电子噪声成为决定因素。在针孔处图像亮度是受多因素影响的,包括激光功率、样品中荧光色品密度、物镜的数值孔径、共聚焦倍率因子、光栅扫描速度、荧光滤片组件的选择等。在共聚焦显微镜中,通常改善信噪比的方法是通过降低扫描速率来增加光量。

瞬时分辨率取决于光栅扫描速率和PMT探测器、模数转换器和计算机处理速率。在共聚焦显微镜中,每秒通常能给出2帧512×512像素图像,每秒100帧或更高速率只能实现于有限尺寸的图像。

总之,在共聚焦显微镜中光学性能是受诸多因素影响的。我们不可能对一个确定的样品和显微镜在时间、空间和强度上都同时优化获得。因此,我们必须采取折衷方法。例如,为了优化光强的分辨率从而能获得高信噪比图像,就可能需要减小空间分辨率或图像瞬时分辨率。如何平衡这些参数来获得高质量共聚焦图像,这与操作者的知识和经验密切相关。

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