咔唑比色法

1.原理

果胶水解生成半乳糖醛酸，在硫酸溶液中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，其橙色强度与半乳糖醛酸的含量成正比，可比色定量。

2.试剂

硫酸，分析纯; 无水乙醇; 0.05mol/L盐酸溶液。

①精制乙醇: 取无水乙醇或95%的乙醇1000m L，加入锌粉4g及硫酸(1+1)4m L，置恒温水浴中回流10h，然后用全玻璃仪器蒸馏，馏出液每1000m L加入锌粉和KOH各4g，进行重蒸馏。

②1.5g/L咔唑乙醇溶液: 溶解0.15g咔唑与100m L精制乙醇中。

③半乳糖醛酸标准工作液: 准确称取α-D-水解半乳糖醛酸100mg，用水溶解并定容至100m L，混匀后得标准贮备液(1mg/m L)。吸取不同量的标准贮备液，用水稀释，配制一组浓度分别为0，10μg/m L，20μg/m L，30μg/m L，40μg/m L，50μg/m L，60μg/m L和70 μg/m L的半乳糖醛酸标准工作液。

3.仪器

分光光度计，恒温水浴锅。

4.操作方法

1)标准曲线的绘制

取大试管(30mm×200mm)8支，各加入浓硫酸12m L置冰水浴中边冷却边徐徐加入上述浓度为0～70μg/m L的半乳糖醛酸的标准工作液2m L。充分混合后再置于冰水浴中冷却。

在沸水浴中加热10min后，冷却至室温，然后各加入1.5g/L咔唑乙醇1m L，充分混合。室温下放置30min后，以0号管调节零点，在波长530nm下，分别测定上述标准系列的吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，每毫升标准溶液中半乳糖醛酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

2)样品测定

①样品处理: 同重量法。

②果胶的提取: 同重量法。

③测定: 取果胶提取液，用水稀释至合适的浓度(含半乳糖醛酸10～70μg/m L)。然后准确移取此稀释液2m L，按照上述标准曲线的制作方法同样操作，测定其吸光度，由标准曲线查出果胶稀释液中半乳糖醛酸的浓度(μg/m L)。

5.结果计算

式中: X——样品中果胶物质(以半乳糖醛酸计)质量分数，%;

V——果胶提取液总体积，m L;

K——提取液稀释倍数;

c——从标准曲线上查得的半乳糖醛酸浓度，μg/m L;

m——样品质量，g。

6.说明及注意事项

①应用咔唑比色法测定果胶含量时，其试样的提取液必须是不含糖的溶液。糖的存在，对呈色反应将会产生很大的干扰，从而导致测定结果偏高。

②比色法较果胶酸钙重量法操作简便，快速，准确度高，重现性较好，同一试样5次测定结果的标准误差为±(0.46～1.51)。

③硫酸的浓度对呈色反应影响较大，在低浓度的硫酸中，呈色的程度较低，颜色较浅，只有在较高浓度的硫酸中才可以充分地呈色，故在实验过程中要使用同一规格、同一批号的浓硫酸，尽量减少误差。