考马氏亮蓝－染色法

此方法是1976年Bradform建立的。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快捷，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。

1. 原理

考马氏亮蓝G-250具有红色和青色两种色调，在酸性溶液中游离状态下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。

2. 试剂和材料

①考马氏亮蓝G-250染色液: 称取100mg考马氏亮蓝G-250溶解于50m L95%的乙醇中，加入100m L85%的磷酸，加入稀释到1L。

②蛋白标准溶液(0.1mg/m L): 准确称取10mg牛血清白蛋白，在100m L容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，-20℃冰箱保存。

3. 分析步骤

1)标准曲线的制备

按表9-3操作，在试管中分别加入0μg，20μg，40μg，80μg，100μg蛋白标准溶液，用水补足到100μL，加入3m L的染色液，混匀后室温放置15min。

表9－3 考马氏亮蓝法标准曲线中试剂的添加量

在波长595nm比色，读出吸光度，以各管的蛋白标准浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。

2)样品蛋白质测定

稀释蛋白样品溶液，准确吸取0.1m L蛋白样品加入样品管，同时以蛋白质标准溶液作为阳性对照(标准管)，蒸馏水作为阴性对照(空白管)，按表9-4操作。混匀后室温放置15 min，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。

表9－4 考马氏亮蓝法蛋白测定中试剂的添加量

4. 分析结果的表述

根据吸光度，查找标准曲线求得样品蛋白含量。

5. 说明与注意事项

①有些常用试剂在测定中会产生不同程度的干扰。Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢剂有较少影响，而1%SDS，1% Triton X-100及1%Hemosol的干扰严重。

②显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。

③考马氏亮蓝G-250染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗。颜色的吸附对本次测定影响很大。可将测量杯在0.1mol/LHCl中浸泡数小时，再冲洗干净即可。