氨基酸的显色反应

1.茚三酮法

1)原理

α氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。

2)试剂和材料

①氨基酸标准溶液: a. 0.01mol/L丙氨酸: 称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10m L。b. 0.01mol/L精氨酸: 称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10m L。c. 0.01 mol/L甘氨酸: 称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10m L。

②混合氨基酸溶液: 将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。

③硅胶G。

④0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na): 取羧甲基纤维素钠5g溶于1000m L蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清液备用。

⑤展开溶剂: 按80 10 10的体积比例混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。

(6)0.1%茚三酮溶液: 取茚三酮0.1g溶于无水丙酮至100m L。

(7)展层-显色剂: 按照10 1的体积比例混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。

3)分析步骤

(1)制板

称取硅胶3g，加0.5%的羧甲基纤维素钠8m L，调成均匀的糊状。取洁净的干燥玻璃板均匀涂层，将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h，自然晾干，70℃烘干60min。

(2)点样

用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。每个样品间相距1cm。用毛细管分别吸取丙氨酸标准溶液、精氨酸标准溶液、甘氨酸标准溶液及混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不超过2mm。点样后用电吹风轻轻吹干，必要时重复加样。

(3)层析

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线。

(4)显色

用热风吹干或在90℃下烘干30min，即可显出各层斑点。

4)分析结果的表述

记录各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离，以及溶剂前缘至样品原点中心距离。对照标准氨基酸，可标定混合氨基酸中氨基酸的种类。

5)说明与注意事项

①薄层层析用的吸附剂如氧化铝和硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜，如果颗粒太大，展开时溶剂推进速度太快，分离效果不好。反之，颗粒太小，展开时太慢，斑点易拖尾，分离效果不好。

②整个层析过程中，避免用手接触层析板，必要时戴上手套。

图9－2 薄层层析装置

2. 吲哚醌法

1)原理

各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辨认氨基酸。氨对吲哚醌显色没有妨碍，但此法灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。

2)试剂和材料

①显色剂: 1g吲哚醌溶于100m L乙醇及10m L冰乙酸(若冰乙酸用量减少则灵敏度稍差)。

②底物退色剂: 在100m L、200g/L碳酸钠溶液中加入60g硅酸钠(Na2Si O3·9H2O)，在水浴(60～70℃)中加热搅拌直至完全溶解，待溶液比较清澈为止。在溶解过程中，有时硅酸钠会结成凝胶，此时只需继续搅拌即可溶解。配制时若硅酸钠用量多则退色较快，但背景容易变黄，硅酸钠用得少(40g)，虽退色较慢，但背景较为洁白。

3)分析步骤

层析或电泳后滤纸烘干，仔细喷上或涂上显色剂，用电吹风迅速吹干，待乙酸气味不太刺鼻时移置100℃烘箱烘5～15min，直至显色为止(温度不要太高，以免引起减色)，注意观察所显出的颜色，然后均匀地涂上底色退色剂，纸的背景即由黄色变成绛红而后逐渐变迁，待黄色背景几乎退尽时，迅速用电吹风吹干，并随时观察颜色的变化。例如苏氨酸在退色前为浅红带褐色，退色后则呈橙黄色或黄色; 脯氨酸在退色前为蓝色，吹干时很快退成无色。市委较低时，底色退色很慢，此时可将退色剂加温到30～40℃。温度也不宜过高，因氨基酸半点的退色速度也同时很快，应该避免。

3.邻苯二甲醛法

邻苯二甲醛法作为近年发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。

1)原理

邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最合适的激发光和发射光波长分别为340nm和455nm。

各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小的大致顺序如下: 天冬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸和半胱氨酸。

2)试剂和材料

邻苯二甲醛显色液: 取0.1g邻苯二甲醛，0.1mg巯基乙醇，1m L三乙胺，加丙酮石油醚混合液(60～90℃，1 1)至100m L，放置0.5h后使用。

3)分析步骤

将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中1min，冷风吹干，在温度18℃以下，湿度50%～90%之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。

4)说明与注意事项

在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以0.1%为宜。显色时必须有一定的湿度，以便氨基酸溶解，提高分子碰撞几率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显不出荧光。温度对显现的荧光延时有显著影响，温度高则荧光延时短，温度低则荧光延时长。