食品中维生素的测定

维生素D(vitamin D) 为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，具有维生素D活性的化合物约有10种，其中最重要的是D2和D3及维生素D原。植物不含维生素D，但维生素D原在动、植物体内都存在。植物中的麦角醇为维生素D2原，经紫外照射后可转变为维生素D2，又名麦角钙化醇(ergocalciferol); 人和动物皮下含的7-脱氢胆固醇为维生素D3原，在紫外照射后转变成维生素D3，又名胆钙化醇(cholecalciferol)。

1.高效液相色谱法

1)原理

试样经皂化后，用苯提取不皂化物，馏去苯后，使用第一阶段的分取型HPLC，分取维生素D组分，以去除大部分干扰物质。得到的维生素D组分，用于第二阶段分析型HPLC，得样品色谱图，与按同样操作条件得到的维生素D标准品的色谱图比较进行定量。

2)试剂

①10%焦性没食子酸-乙醇溶液。

②90%氢氧化钾溶液。

③1mol/L氢氧化钾溶液。

④无醛乙醇。

⑤苯: 特级。

⑥正己烷: 色谱纯。

⑦乙腈。

⑧异丙醇。

⑨甲醇: 色谱纯。

⑩维生素D标准溶液: 称取0.2500g维生素D，用乙醇溶解并定容至100m L棕色容量瓶中为储备液，此溶液浓度为2.5mg/m L(相当于100000IU/m L)。临用时，用乙醇配制成0.1μg/m L(相当于4IU/m L)的标准使用液。标准储备液在-10℃以下避光储存。

3)仪器

①高效液相色谱仪，附紫外检测器。

②旋转蒸发器。

③恒温磁力搅拌器: 20～80℃。

④离心机: 5000r/min以上。

⑤氮吹仪。

4)色谱条件

(1)第一阶段(分取用)

色谱柱: 反相柱Nucleosil5C18，7.5×300mm。

流动相: V乙腈V甲醇=1 1。

流速: 2.0m L/min。

紫外检测器: 波长264nm。

(2)第二阶段(分析用)

色谱柱: 正相柱Zorbax SIL，4.5×250mm。

流动相: 0.4%异丙酮的己烷溶液。

流速: 1.6m L/min。

紫外检测器: 波长264nm。

5)测定步骤

(1)样品的皂化及不皂化物的提取

准确称取粉碎的样品1～10g(维生素D含量在0.05μg以下)置于皂化瓶中，加入40 m L10%焦性没食子酸-乙醇溶液及10m L90% KOH溶液，装上回流装置，在沸水浴上皂化30min，然后用流动冷水冷却至室温，准确加入100m L苯，塞上瓶塞，激烈振混15秒，然后移入200～250m L分液漏斗中(如有沉淀物就留在烧瓶中，此时不需要用苯洗皂化瓶)，加入1mol/L氢氧化钾溶液50m L，振摇后静置，弃去水层。再加0.5mol/LKOH溶液50m L，振摇后静置，弃去水层。再每次用50m L水洗涤苯层数次，直至用酚酞检验时洗液不呈碱性为止。分液漏斗静置几分钟，直至最后一滴水分离，弃去水。

(2)维生素D的分取

准确吸取上述苯溶液80m L于圆底烧瓶内，在40℃以下的温度减压蒸去苯，所得残留物中准确加入5m L正己烷使之溶解，取4.5m L置于10m L具塞试管内，减压蒸去溶剂，残留物中准确加入乙腈-甲醇(1 1)溶液500μL使之溶解。准确吸取该溶液200μL，注入分取用色谱柱中。事先用标准维生素D确定其溶出位置，用馏分收集器收集维生素D组分(本实验色谱条件下维生素D保留时间为17～18min，收集其16～19min溶出的组分)。

(3)维生素D的定量

减压蒸馏维生素D组分中的溶剂，残留物溶解在200μL的0.4%异丙酮正己烷溶液中，取其中100μL注入分析用色谱柱中，得样品色谱图。取维生素D标准液1m L，按上述操作，得标准维生素D色谱图。

6)结果计算

式中: X——维生素D的含量，μg/100g;

Hsa——样品色谱图中维生素D的峰高(或面积);

Hst——标准溶液色谱图中维生素D的峰高(或面积);

V——样品定容总体积，m L;

c——维生素D标准液的浓度，μg/m L;

m——取样质量，g。

7)说明及注意事项

①使用两级HPLC，反相型柱可把维生素D与其他干扰物分离，分取的维生素D应在半日内更换柱子后测定，如超过半日应封入惰性气体冷冻保存、再改换柱子测定。本法对维生素D2和D3不加区别，两者混合存在时，以总维生素D定量。

②焦性没食子酸的作用是抗氧化。

③水洗苯提取的不皂化物时，为防止因形成胶粒而在水中损失，用1mol/LKOH溶液、0.5mol/LKOH溶液及水洗，使碱的浓度逐渐降低。

④可用毛地黄皂苷-硅藻土及皂土柱层析去除甾醇、维生素A和胡萝卜素等干扰成分。

⑤按国际单位，每1IU相当于0.025μg维生素D。

2.三氯化锑比色法

1)原理

在三氯甲烷中，维生素D与三氯化锑生成橙黄色化合物，并在500nm波长处有最大吸收，呈色强度与维生素D的含量成正比。

2)试剂

①氯仿、乙醚、乙醇，同三氧化锑比色法测定维生素A。

②三氯化锑-氯仿溶液: 用三氯甲烷配制三氯化锑溶液，将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100m L三氯甲烷的棕色试剂瓶中，振摇，使之溶解，再加无水硫酸钠10g，用时取上清液。

③三氧化锑-氯仿-乙酰氯溶液: 取上述三氯化锑-氯仿溶液，加入其体积3%的乙酰氯，摇匀。

④石油醚: 沸程30℃～60℃，重蒸馏。

⑤维生素D标准溶液: 称取0.2500g维生素D，用氯仿稀释至100m L，此溶液浓度为2.5mg/m L，临用时，用氯仿配制成0.025～2.5μg/m L的标准使用液。

⑥聚乙二醇(PEG)600。

⑦白色硅藻土: Celite545(柱层析载体)。

⑧无水硫酸钠。

⑨0.5mol/L氧氧化钾溶液。

⑩中性氧化铝: 层析用，100～200目。在550℃高温电炉中活化5.5h，降温至300℃左右取出装瓶。冷却后，每100g氧化铝中加入水4m L，用力振摇，使无块状，瓶口密封后贮存于干燥器内，16h后使用。

3)仪器

①分光光度计。

②层析柱: 内径2.2cm，具活塞，砂芯板。

4)操作步骤

(1)样品的处理

皂化和提取同维生素A的测定。如果样品中有维生素A共存时，必须进行纯化、分离维生素A。

①分离柱的制备: 在内径为22mm具活塞和砂芯板的玻璃层析柱中先加1～2g无水硫酸钠，铺平整，此为第一层。第二层，称取15g Celite545置于250m L碘价瓶中，加入80m L石油醚，振摇2min，再加入10m L聚乙二醇600，剧烈振摇10min使其黏合均匀。将上述黏合物加到玻璃层析柱内。第三层，黏合物上面加入5g中性氧化铝。第四层，再加2～4g无水硫酸钠。轻轻转动层析柱，使柱内的黏合物高度(第二层)保持在12cm左右。

②纯化: 柱装填后，先用30m L左右的石油醚进行淋洗，然后将样品提取液倒入柱内，再用石油醚淋洗，弃去最初收集的10m L，再用200m L容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗液的流速保持在2～3m L/min。将淋洗液移入500m L分液漏斗中，每次加入100～150m L水用力振摇，洗涤三次，弃去水层(水洗主要是去除残留的聚乙二醇，以免与三氧化锑作用形成浑浊，影响测定)。将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水，移入锥形瓶或脂肪烧瓶中，在水浴上浓缩至约5m L或在水浴上用水泵减压至干，立即加入5m L氯仿，加塞摇匀备用。

(2)测定

①标准曲线的绘制: 准确吸取维生素D标准使用液(浓度视样品中维生素D含量高低而定)0m L，1.0m L，2.0m L，3.0m L，4.0m L，5.0m L于6个10m L容量瓶中，用氯仿定容，摇匀。分别吸取上述标准溶液各1m L于1cm比色杯中，置于分光光度计的比色槽内，立即加入三氧化锑-氯仿-乙酰氯溶液3m L，以0号管调零，在500nm波长下于2min内测定吸光度值，绘制标准曲线。

②样品的测定: 吸取上述已纯化的样品溶液lm L于1cm比色皿中，以下操作同标准曲线的绘制。根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出其相应的含量。

5)结果计算

式中: X——样品中维生素D的含量，μg/100g;

c——标准曲线上查得样品溶液中维生素D的含量，μg/m L;

V——样品提取氯仿定容之体积，m L;

m——样品质量，g。

6)说明及注意事项

①测定中加入乙酰氯可以消除温度、湿度等干扰因素的影响，提高检测灵敏度。

②食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇等成分的含量往往大大超过维生素D，严重干扰维生素D的测定，因此测定前须经柱层析除去这些干扰成分。

③本法测定的是维生素D2、维生素D3的总量。