活性多糖含量的测定

1. 苯酚-硫酸法测定多糖

1)原理

苯酚-硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖及糠醛酸起显色反应，呈橘红色，己糖反应产物在490nm处(戊糖及糖醛酸在480nm处)有最大吸收，吸光度与糖含量呈线性关系。

2)仪器

①水浴锅;

②离心机;

③分光光度计。

3)试剂

①葡萄糖标准液: 精确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖100mg，置100m L容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度。

②5%苯酚溶液: 称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100m L棕色容量瓶中，混匀。溶液置于4℃冰箱中，可保存1个月。

③硫酸、乙醇、三氯乙酸、石油醚、80%乙醚等均为分析纯。

4)操作方法

(1)样品的制备

①水提醇沉法: 将样品烘干、研碎，过40目筛。取研成粉末的固体样品10g，加100m L蒸馏水，在100℃水浴中煮沸1h，重复3次。提取液过滤，浓缩至1 1(g/m L)，加3倍量的95%乙醇置于冰箱中冷藏24h使其沉淀; 抽滤，将沉淀物按1 25的比例加蒸馏水溶解，过滤，在滤液中加95%乙醇，冷藏后抽滤; 将沉淀物用蒸馏水溶解后，加三氯乙酸，使三氯甲酸含量为15%，离心25min，取上清液加入95%乙醇，使溶液中乙醇浓度达75%，抽滤; 取残留物水溶后，装入透析袋(相对分子质量10000～70000)内，透析3h，透析液冷冻干燥后，得到多糖粗品。

②酶法: 将干燥样品按1 80加水在室温下(20～25℃)浸泡30min，置于高速组织捣碎机中充分捣碎，制成浆液。将p H调至6.3，加入1%复合酶制剂(果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶)，在50℃下酶促反应40min，迅速升温至80℃灭酶，并保温浸提约1.5h，用乙醇沉淀，残留物水溶后浓缩，装入透析袋(相对分子质量10000～70000)内，透析3h，透析液冷冻干燥后，得到多糖粗品。

③脱脂法: 称取干燥粉碎的样品100g，经500m L石油醚(60～90℃)回流脱脂2次，每次2h，回收石油醚。再用500m L乙醚浸泡过夜，回收提取2次，每次2h。将滤渣加蒸馏水3000m L，90℃热提取1h，滤液减压浓缩至300m L，用氯仿多次萃取以除去蛋白质，加1%活性炭脱色，抽滤，滤液加入95%乙醇，使含醇量达80%，静置过夜，过滤。沉淀物用无水乙醇、丙醇、乙醚多次洗涤，真空干燥，即得多糖粗品(适合于脂肪含量多的多糖样品，如枸杞、山药等)。

(2)标准曲线(standard curve)的绘制

吸取葡萄糖标准液10μL，20μL，40μL，60μL，80μL，100μL，分别置于带塞试管中，各加蒸馏水使体积为2.0m L，再加苯酚试液1.0m L，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0m L，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温; 另以蒸馏水2m L，加苯酚和硫酸，同上操作做空白对照。于490nm处测吸光度，绘制标准曲线。

(3)样品溶液的制备

精确称取样品粉末0.2g，置于圆底烧瓶中，加80%乙醇100m L回流提取1h，趁热过滤，残渣用80%乙醇洗涤3次，每次用量10 m L。残渣连同滤纸置于烧瓶中，加蒸馏水100m L，加热提取1h，趁热过滤，残渣用热水洗涤3次，每次用量10m L，洗液并入滤液，放冷后移入250m L量瓶中，稀释至刻度，备用。

(4)样品中多糖含量测定

吸取适量样品液，加蒸馏水至2m L，按标准曲线制备项下方法测定吸光度。查标准曲线得样品液中葡萄糖浓度(μg/m L)。

5)结果计算

按下式计算样品中多糖含量:

式中: ρ——样液葡萄糖浓度，μg/m L;

V——样品液体积;

D——样品溶液稀释倍数;

0．9——葡萄糖换算为粗多糖的系数;

m——样品质量，μg。

6)说明及注意事项

①用苯酚-硫酸法测定样品中的多糖含量时，提取时间以1h为宜，提取时间太长可能会引起糖结构变化甚至使碳键断裂，导致所测多糖含量降低。

②配制好的苯酚溶液应冷藏避光保存，否则以苯酚-硫酸做空白时颜色变深，影响测定结果。

③对于添加了淀粉、糊精的保健食品，要做相应的处理，否则结果偏高。对于添加淀粉的样品，需加α-淀粉酶及糖化酶(如葡萄糖苷酶)处理。添加糊精的样品则需加糖化酶(如葡萄糖苷酶)处理。

④粗多糖测定结果最终如果用葡萄糖作对照品，粗多糖的计算结果乘以0.9; 如果是粗多糖的计算结果(以葡萄糖计)就不用乘以0.9; 如以被测物的纯品作对照就应乘以换算因子(F)。

准确称取被测物质的纯品200mg于100m L容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，吸取适量于25m L具塞比色管中，加水至2.0m L，按上法测定，从标准曲线中查出供试液中相当于标准葡萄糖的质量(mg):

式中: m——多糖纯品的质量，mg;

m1——多糖纯品供试液中相当于葡萄糖的质量，mg;

n——供试液的稀释倍数。

例: 灵芝多糖纯品22.4mg，加水溶解并稀释至100m L，吸取0.4m L于25m L具塞比色管中，加水至2.0m L，按上法测定，相当于标准葡萄糖0.0288mg:

2.蒽酮-硫酸法测定多糖

1)原理

多糖遇浓硫酸脱水生成的糠醛或其衍生物，可与蒽酮(anthrone)试剂发生缩合反应，生成的蓝绿色化合物在625nm处有最大吸收，吸光度与多糖含量呈正比。

2)仪器

分光光度计。

3)试剂

①葡萄糖标准溶液(1mg/m L);

②0.1%蒽酮试剂: 称取0.1g蒽酮，用硫酸溶解并定容至100m L(使用前新配);

③80%乙醇。

4)操作步骤

(1)样品的制备

同苯酚-硫酸法中样品的制备。

(2)标准曲线的绘制

分别吸取1mg/m L的葡萄糖标准溶液1.0m L，2.0m L，4.0m L，6.0m L，8.0m L置于100m L容量瓶中定容，精确吸取上述标准液各2.0m L置于10m L比色管中，于冰浴中加入0.1%蒽酮试剂5m L，摇匀，于水浴中加热50min，冷却至室温。另取2.0m L蒸馏水作空白，于波长625nm处测吸光度，绘制标准曲线。

(3)多糖含量的测定

精密称取3.0g样品粉末，加蒸馏水回流2h，过滤，定容至200m L，备用。取样品液0.5m L，加入80%乙醇10m L，摇匀，以4000r/min离心10min，弃去上清液，再加80%乙醇10m L，同法操作2次。沉淀加适量蒸馏水溶解定容至50m L，即成供试液。取供试液2.00 m L，置于10m L比色管中，于冰浴中加入0.1%蒽酮试剂5m L，摇匀，于水浴中加热50min，冷却至室温。另取2.0m L蒸馏水作空白，于波长625nm处测吸光度。

5)结果计算

式中: ρ——样液葡萄糖浓度，μg/m L;

V——样品液体积;

D——样品溶液稀释倍数;

0．9——葡萄糖换算为粗多糖的系数;

m——样品质量，μg。

6)说明及注意事项

①蒽酮试剂应现用现配，配制好的蒽酮试剂应冷藏避光保存，否则以蒽酮-硫酸作空白时颜色较深，影响测定结果。

②根据样品的含糖量选择稀释倍数，使最终供试液中糖浓度在1.0～2.0mg/m L，并使吸光度值在0.1～0.3之间为宜。

③蒽酮反应并非多糖特异性反应，样液中的微量碳水化合物(单糖、双糖、淀粉)在此实验条件下均能与蒽酮显色，所以对样品的纯度要求较高，样液必须清澈透明。因此，样品颜色较深时，可用活性炭脱色后再进行测定。

④蒽酮反应颜色的深浅随温度条件和加温时间而变化，测定方法所用蒽酮试剂中硫酸的浓度(66%～98%)、取样液量(1～5m L)、蒽酮试剂用量(5～20m L)、沸水浴中反应时间(6～13min)，这几个操作条件时间是有联系的。因此，采用此法控制反应条件很重要，否则会影响分析结果。

⑤粗多糖测定结果最终如果用葡萄糖作对照品，粗多糖的计算结果乘以0.9; 如果是粗多糖的计算结果(以葡萄糖计)就不用乘以0.9; 如以被测物的纯品作对照就应乘以换算因子(F)。

3.高效液相色谱法测定香菇多糖

1)原理

采用高效色谱法分析香菇多糖(lentinan)，选用TSK-SW凝胶排斥色谱柱为分离柱，香菇样品经简单的预处理，在示差折光检测器中进行检测，以不同分子量标准右旋糖酐(dextran)作为标准，同时测定样品中多糖的相对分子质量分布情况及含量。

该方法较其他多糖测定法具有快速、简便、准确等优点，是目前较为有效的测定方法。

2)仪器

①高效液相色谱仪，包括126双溶剂微流量泵，156示差折光检测器，System Gold控制及数据处理系统(带有相对分子质量计算辅助软件);

②分离柱: 4000SWSpherogel TSK，7.5mm×300mm，内径13μm;

③微孔过滤器(带0.3μm微孔滤膜)。

3)试剂

右旋糖酐、无水硫酸钠、醋酸钠、碳酸氢钠、氯化钠等。

4)操作步骤

(1)色谱条件

流动相: 0.2mol/L硫酸钠溶液; 流速: 0.8m L/min; 检测条件: 示差检测器(以流动相作参比液，灵敏度16AUFS)。

(2)相对分子质量标准曲线绘制

精确称取不同相对分子质量的右旋糖酐标准品0.100g，用流动相溶解并定容至10m L。分别进样20μL，由分离得到各色谱峰的保留时间，将其数字输入相对分子质量软件中，经校准后建立相对分子质量对数值(lg MW)与保留时间(RT)的标准曲线。结果表明，分子量在3.9×104～2.0×106范围内具有良好的线性关系。

(3)标准工作曲线的绘制

精确称取相对分子质量50000的右旋糖酐0.100g，定容在5m L定量瓶中，再进一步稀释为10mg/m L，5mg/m L，2mg/m L，1mg/m L标准液。分别进样，根据浓度与峰面积关系绘制曲线。

(4)样品预处理和测定

称取一定量样品(多糖含量应大于1mg)，用流动相溶解并定容至100m L，混匀后经0.3 μm的微孔滤膜过滤后即可进样。若样液不易过滤，可将其移入离心管中，在5000r/min下离心20min，吸取5m L左右的上清液，再经0.3μm的抽孔滤膜过滤，收集少量滤液按色谱条件进样测定。

5)结果计算

(1)相对分子质量分布计算

等测样品经分离后得到不同相对分子质量峰的保留时间值，通过相对分子质量标准工作曲线即可计算出多糖相对分子质量分布。该计算程序由相对分子质量辅助软件自动进行。

(2)多糖含量计算

选择与待测样品多糖相对分子质量相近的标准右旋糖酐为基准物质，用峰面积外标法定量，多糖含量(以右旋糖酐计)计算公式如下:

式中: ρ——进样样液多糖浓度，mg/m L;

m——样品质量，g或m L;

V——提取液的体积，m L。